（5）在预杂交液中加入变性的放射性标记探针，如欲检测低丰度mRNA，所用探针的量至少为0．1μg，其放射性比活度应大于2×108cpm／min·μg，放在适宜的温度条件下杂交16～24h。
（6）用1×SSC、0．1％SDS于室温洗膜20min，随后用0．2×SSC、0．1％SDS于68℃洗膜3次，每次20min。
（7）用X线片（Kodak XAR－2或与之相当的产品）进行放射自显影，附加增感屏于－70℃曝光24～48h。
【注意事项】
（1）如果琼脂糖浓度高于1％，或凝胶厚度大于0．5cm，或待分析的RNA大于2．5kb，需用0．05mol／L NaOH浸泡凝胶20min，部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用经DEPC处理的水淋洗凝胶，并用20×SSC浸泡凝胶45min。然后再转移到滤膜上。
（2）在步骤（3）的操作中，如果滤膜上含有乙醛酰RNA，杂交前需用20mmol／L Tris·Cl（pH 8．0）于65℃洗膜，以除去RNA上的乙二醛分子。
（3）RNA自凝胶转移至尼龙膜所用方法，与RNA转移至硝酸纤维素滤膜所用方法类似。
（4）含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经DEPC处理的水淋洗数次，以除去甲醛。当使用尼龙膜杂交时注意，有些带正电荷的尼龙膜在碱性溶液中具有固着核酸的能力，需用7．5mmol／L，NaOH溶液洗脱琼脂糖中的乙醛酰RNA，同时可部分水解RNA，并提高较长RNA分子（＞2．3kb）转移的速度和效率。此外，碱可以除去mRNA分子的乙二醛加合物．免去固定后洗脱的步骤。乙醛酰RNA在碱性条件下转移至带正电荷尼龙膜的操作也按DNA转移的方法进行，但转移缓冲液为7．5mmol／LNaOH，转移结束后（4．5～6．0h），尼龙膜需用2×SSC、0．1％SDS淋洗片刻，于室温晾干。
（5）尼龙膜的不足之处是背景较高，用RNA探针时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中，会导致杂交背景明显升高，可通过提高预杂交和杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。如用中性缓冲液进行RNA转移，转移结束后，将晾干的尼龙膜夹在两张滤纸中间，80℃干烤0．5～2h，或者254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。后一种方法较为繁琐，但却优先使用，因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后，杂变信号可以增强。然而为获得最佳效果，务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构，而过度照射却使RNA上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。
（三）茵落原位杂交
对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100～200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。
【实验前准备】
（1）材料待检测的细菌平皿，已标记好的探针，硝酸纤维索滤膜等。
（2）设备恒温烤箱，恒温水浴，台式高速离心机等。
（3）试剂LB固体培养基。0．5mol／L NaOH。1mol／L Tris·cl。1．5mol／LNacl。0．5mol／L Tris·cl。预洗液：5×SSC，0．5％SDS，1mmol／L EDTA（pH 8．0）。预杂交渡：50％甲酰胺，6×SSC（或6×SSPE），0．05×BLOTTO（甲酰胺可不用）。其余试剂：与Southern杂交相同。
【操作步骤】
（1）将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上
①在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。
②用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上，再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种（或打点）。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322）的菌落。
③倒置平板，于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0．5～1．0mm的宽度。
④用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂，在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。
⑤用Parafilm膜封好主平板，倒置贮放于4℃，直至获得杂交反应的结果。
（2）菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜裂解细菌，按本段下面所述方法，使释放的DNA结合于硝酸纤维素滤膜。
①在一张保鲜膜上制作一个装有0．5mol／LNaOH的小洼（0．75ml），使菌落面朝上，将滤膜放到小洼上，展平保鲜膜，使滤膜均匀湿润，让滤膜留于原处2～3min。
②用于纸巾从滤膜的下方吸干滤膜，用一张新的保鲜腹和新配制的0．5mol／LNaOH重复步骤①。
③吸干滤膜，将滤膜转移到新的带有1mol／L Tris·Cl（pH 7．4）的保鲜膜洼上。5min后吸干滤膜，再重复一次该步骤。
④吸干滤膜，把它转移到有1．5mol／L NaCl、0．5mol／L Tris·Cl（pH 7．4）的保鲜膜小洼上5min，后吸干滤膜，转移到一张干的滤纸上，置于室温20～30min，使滤膜干燥。
⑤将滤膜夹在两张干的滤纸之间，在真空烤箱中于80℃于烤2h，固定DNA。
（3）杂交将固定在膜上的DNA与（上标32）P标记的探针杂交。
①盛有2×SSC的塑料盘，将干烤的滤膜漂浮在液面上，彻底浸湿5min。
②将滤膜转到200ml预洗液的玻璃皿中。滤膜可叠在一起，放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿，放到位于培养箱内的旋转平台上。于50℃处理30min。在这一步及以后的所有步骤中，应缓缓摇动滤膜，防止它们粘在一起。
③用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片，以降低杂交背景而不影响阳性杂交信号的强度和清晰度。
④将滤膜转到盛有150ml预杂交液的玻璃皿中，在适宜温度（即在水溶液中杂交时用68℃，而在50％甲酰胺中杂交时用42℃）下，预杂交1～2h。
⑤将（上标32）P标记的双链DNA探针于100℃加热5min，迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。
⑥杂交结束后，去除杂交液，立即于室温把滤膜放人大体积（300～500ml）的2×SSC和0．1％SDS溶液中，轻轻振摇5min，并将滤膜至少翻转一次。重复洗一次，同时应避免膜干涸。
⑦68℃用300～500ml 1×SSC和0．1％SDS溶液洗膜两次，每次1～1．5h。此时已可进行放射自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件，可用300～500ml0．2×SSC和0．1％SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60min。
⑨把滤膜放在纸巾上于室温晾干后，把滤膜（编号面朝上）放在一张保鲜膜上，并在保鲜膜上作几个不对称的标记，以使滤膜与放射性自显影片位置对应。
⑨用第二张保鲜膜盖住滤膜。加X线片并加上增感屏于－70℃曝光12～16h。
⑩底片显影后，在底片上贴一张透明硬纸片。在纸上标记阳性杂交信呼的位置，同时在不对称分布点的位置上作出标记。可从底片上取下透明纸，通过对比纸上的点与琼脂卜的点来鉴定阳性菌落。
（四）斑点杂交
斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释，还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法，在基因分析和基因诊断中经常用到，是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离，不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时，难以区分目的序列信号和干扰信号。
【实验前准备】
（1）材料待分析的DNA或RNA样品，已标记的探针。
（2）设备狭槽点样器，真空泵，恒温水浴，真空烤箱等。
（3）试剂100％甲酰胺。甲醛（37％）。20×SSC。0．lmol／L NaOH。硝酸纤维素滤膜。滤纸。
【操作步骤】
（1）10μl样品与20μl100％甲酰胺、7μl 37％甲醛、2μl 20×SSC混合。混合置于68℃，15min后置冰浴中。
（2）用0．lmol／L NaOH清洗点样器，再用无菌水充分冲洗。将一张经20×SSC浸润的滤纸铺在点样器上，上面再铺上一张经20×SSC浸润1h的硝酸纤维素滤膜，加盖并夹紧，接通真空泵。
（3）用10×SSC清洗各样孔。在每一样品中加两倍体积的2×SSC，混合后加样于孔中。外围几个孔中加2μl染料定位，缓慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC清洗两次。继续抽吸5min，吸干滤膜。
（4）取出滤膜，夹在两张滤纸中间，80℃真空烘干2h。按上述southern或Northern杂交所述的方法与放射性标记探针杂交。
【注意事项】
（1）在放射自显影时应注意滤膜必须干燥，并覆盖上保鲜膜，否则，滤膜将与X线片粘在起，使以后的操作困难。
（2）在杂交过程中，整个滤膜应直是湿润的，不得干涸。
三、杂交反应的条件及参数的优化
不同的反应条件对杂交结果的影响如下。
（1）根据杂交液的体积确定杂交的时间一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的DNA在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。
（2）根据所用的杂交溶液确定杂交的温度一般来说，杂交相为水溶液时，则在68℃杂交，而在50％甲酰胺溶液中时，则在42℃以下杂交。
（3）选用不同的封闭试剂如Denhardt’s试剂、肝素或一种由5％脱脂奶粉组成的BLOTTO，这些试剂中需加入断裂的鲑鱼精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。与Denhardtt’s试剂相比，BLOTTO价格便宜，使用方便，同样可获得满意的结果，但它不能用于RNA杂交。一般而言，尼龙膜用Denhardt’s试剂比用BLOTTO能得到更高的信噪比。对硝酸纤维素滤膜而言，通常在预杂交溶液和杂交溶液中都含有封闭剂。但是对尼龙膜，经常从杂交溶液中省去封闭剂，因为高浓度的蛋白质会干扰探针和目的基因的退火。
（4）根据需要在杂交过程中选用不同的振荡方法和程度，许多杂交膜一起反应时，连续的轻微振荡可获得较好的杂交结果。
（5）在杂交过程中加入其他化合物，如反应体系中加入10％硫酸葡聚糖或10％PEG，杂交速度可增加约10倍。检测稀有序列时常用该方法，但它们有时会导致本底较高，并由于溶液的黏稠性而使操作困难。因此，除非在滤膜上含有的目的DNA量很少，或放射性探针的量有限，一般不用硫酸葡聚糖或PEG。
（6）根据探针与被检测目标之间的同源程度选择清洗的程度，如具有很高的同源性可选用严紧型洗脱方式（高浓度SSC），反之则选用非严紧型洗脱方式（低浓度SSC）。洗脱通常在低于杂交体解链温度12～20℃的条件下进行。解链温度［meltingtemperature，T（下标M）］是指在双链DNA或RNA分子变性形成分开的单链时光吸收度增加的中点处温度。通常富含G·C碱基对的序列比富含A·T碱基对序列的T（下标M）温度高。
（7）根据标记探针的浓度及其比活性，选择不同的杂交条件及检测方法。一般使用新的同位素可获得较强的信号。
在水溶液中杂交时，用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一样。但在甲酰胺溶液中杂交时，应该用具有更强缓冲能力的6×SSPE。
上述这些条件的改变，对杂交的结果有不同的影响，应根据研究的具体情况，选用适当的方法。
