（1）100ng寡核苷酸溶于30ml水中。置65℃变性5min，迅速置冰浴中。
（2）立即加入下列试剂：
10×激酶缓冲液5ml
［γ－（上标32）P］ATP（比活性7000ci／mmol；10mci／ml）10ml
T4多核苷酸激酶2ml
加水至50ml
混匀后置37℃水浴20min。
（3）再加入20单位T4多核苷酸澈酶，置37℃水浴20mm后立即置冰浴中。
（4）sepHadex G－50柱层析。
此方法是在每个探针的5＇末端多加了一个磷酸，理论上，这会影响其与DNA的杂交。因此，建议使用Klenow DNA聚合酶的链延伸法获得高放射性的寡核苷酸探针。
除了常见的同位素标记探针外，还有利用非同位素标记探针和杂交的方法，许多公司都有不同的非同位素标记探针的杂交系统出售，可根据这些公司所提供的操作步骤进行探针的标记和杂交。
（五）RNA探针
许多载体如pBluescript，pGEM等均带有来自噬菌体SP6或E．coli噬菌体T7或T3的启动子，它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶所识别，合成特异性的RNA。在反应体系中若加入经标记的NTP，则可合成RNA探针。
RNA探针一般都是单链，它具有单链DNA探针的优点，又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是：RNA：RNA杂交体比DNA：DNA杂交体有更高的稳定性，所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。RNA：RNA杂交体用RNA酶A酶切比S1酶切DNA：RNA杂交体容易控制，所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。噬菌体依赖DNA的RNA聚合酶所需的rNTP浓度比Klenow片段所需的dNTP浓度低，因而能在较低浓度放射性底物的存在下，合成高比活性的全长探针。用来合成RNA的模板能转录许多次，所以RNA的产量比单链DNA高。反应完毕后，用无RNA酶的DNA酶Ⅰ处理，即可除去模板DNA，而单链DNA探针则需通过凝胶电泳纯化才能与模板DNA分离。
另外噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶不识别克隆DNA序列中的细菌、质粒或真核生物的启动子，对模板的要求也不高，故在异常位点起始RNA合成的比率很低。因此，当将线性质粒和相应的依赖DNA的RNA聚合酶及四种rNTP一起保温时，所有RNA的合成。都由这些噬苗体启动子起始。而在单链DNA探针合成中，若模板中混杂其他DNA片段，则会产生干扰。
但该种探针也存在着不可避免的缺点，因为合成的探针是RNA，它对RNase特别敏感，应而所用的器皿试剂等均应仔细地去除RNase；另外如果载体没有很好地酶切，则等量的超螺旋DNA会合成极长的RNA，它有可能带上质粒的序列而降低特异性。
二、几种常见的杂交
分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类。
（1）Southern杂交DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。
（2）Northem杂交RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维索滤膜上，然后用探针杂交。被控对象为RNA，探针为DNA或RNA。
根据杂交所用的方法，另外还有斑点（dot）杂交、狭槽（slot）杂交和菌落原位杂交等。有3种固相支持体可用于杂交：硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman541滤纸。不同商标的尼龙膜需要进行不同的处理，在DNA固定和杂交的过程中要严格按生产厂家的说明书来进行。Whatman541滤纸有很高的湿强度，最早用于筛选细菌菌落。该滤纸主要用于筛选一些基因文库。固定化DNA的杂交条件基本与使用硝酸纤维素滤膜时所建立的条件相同。whatman541滤纸与硝酸纤维素滤膜相比有一些优点：它更便宜，杂交中更耐用，干燥过程中不易变形和碎裂等。然而若变性过程不小心，杂交信号的强度会明显弱于用硝酸纤维素滤膜时所得到的信号强度。因此，常规的细菌筛选和各种杂交时仍选用硝酸纤维素滤膜作为固相支持体。
（一）Southern杂交
southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
（1）酶切DNA，凝胶电泳分离各酶切片段，然后使DNA原位变性。
（2）将DNA片段转移到固体支持物（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。
（3）预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。
（4）让出探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。
（5）通过显影检查目的DNA所在的位置。
southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素，包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下，放射自显影曝光数天后，southern杂交能很灵敏地检测出低于0．1pg与（上标32）P标记的高比活性探针的（＞109cpm／μg）互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交，曝光过夜，则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。
将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种。
（1）毛细管转移本方法由Southern发明，故又称为Southern转移（或印迹）。毛细管转移方法的优点是简单，不需要用其他仪器；缺点是转移时间较长，转移后杂交信号较弱。
（2）电泳转移将DNA变性后，可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤／水解作用，可直接转移较大的DNA片段；缺点是转移中电流较大，温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时，才采用电泳转移。
（3）真空转移有多种真空转移的商品化仪器，它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上，再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流下，洗脱出凝胶中的DNA，使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速，在30min内就能从正常厚度（4～5mm）和正常琼脂糖浓度（＜1％）的凝胶中定量地转移出来，转移后得到的杂交信号比Southern转移强2～3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛细管转移要高。
【实验前准备】
（1）材料待检测的DNA，已标记好的探针。
（2）设备电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X线片，杂交袋，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，滤纸。
（3）试剂10mg／mll溴化乙锭（EB）。50×Denhardt’s溶液：5g Ficoll－40，5gPvP，5g BSA加水至500ml，过滤除菌后于－20℃储存。1×BLOTTO：5g脱脂奶粉，0．02％叠氮钠，储于4℃。预杂交溶液：6×SSC，5×Denhardt，0．5％SDS，100mg／ml鲑鱼精子DNA，50％甲酰胺。杂交溶液：预杂交溶液中加入变性探针即为杂交溶液。0．2mol／L HCL。0．1％SDS。0．4mol／L NaOH。变性溶液：87．75g Nacl，20．0g NaOH加水至1000ml。中和溶液：175．5g NaCl，6．7g Tris·Cl，加水至1000ml。硝酸纤维素滤膜。20×SSC：3moL Nacl，0．3mol／L柠檬酸钠，用lmol／L HCL调节pH至7．0，2×、1×、0．5×、0．25×和0．1×SSC，用20×SSC稀释。
【操作步骤】
（1）约50μl体积中酶切10pg－10μg的DNA，然后在琼脂糖凝胶中电泳12～24h（包括DNA分子量标准物）。
（2）500ml水中加入25μl 10mg／ml溴化乙锭，将凝胶放置其中染色30min，然后照相。
（3）依次用下列溶液处理凝胶，并轻微摇动：500ml 0．2mol／L HCL l0min，倾去溶液（如果限制性片段＞10kb，酸处理时间为21min），用水清洗数次，倾去溶液；500ml变性溶液两次，每次15min，倾去溶液；500ml中和溶液30min。如果使用尼龙膜杂交，本步可以省略。
（4）戴上手套，在盘中加20×SSC液，将硝酸纤维素滤膜先用无菌水完全湿透，再用20×SSC浸泡。将硝酸纤维素滤膜一次准确地盖在凝胶上，去除气泡。用浸过20×SSC液的3滤纸盖住滤膜，然后加上干的3滤纸和干纸巾，根据DNA复杂程度转移2～12h。当使用尼龙膜杂交时，该膜用水浸润一次即可，转移时用0．4mol／LNaOH代替20×SSC。简单的印迹转移2－3h，对于基因组印迹，一般需要较长时间的转移。
（5）去除纸巾等，用蓝色圆珠笔在滤膜右上角记下转移日期，做好记号，取出滤膜，在2×SSC中洗5min，晾干后在80℃中烘烤2h。注意在使用尼龙膜杂交时，只能空气干燥，不得烘烤。
（6）将滤膜放入含6～10ml预杂交液的密封小塑料袋中，将预杂交液加在袋的底部，前后挤压小袋，使滤膜湿透。在一定温度下（一般为37～42℃）预杂交3～12h，弃去预杂交液。
（7）制备同位素标记探针（参见第一节 ），探针煮沸变性5min。
（8）在杂交液中加入探针，混匀。如步骤（6）将混合液注入密封塑料袋中，在与预杂交相同温度下杂交6～12h。
（9）取出滤膜，依次用下列溶液处理，并轻轻摇动：在室温下，1×SSC／0．1％SDS，15min，两次。在杂交温度下，0．25×SSC／0．1％SDS，15min，两次。
（10）空气干燥硝酸纤维素滤膜，然后在X线片上曝光。通常曝光1～2天后可见DNA谱带。对于≥108cpm／μg从缺口平移所得探针，可很容易地从10μg哺乳DNA中检测到10pg的单拷贝基因。
（二）Northern杂交
Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA，其电泳在变性条件下进行，以去除RNA中的二级结构，保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种：乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上，然后与探针杂交。
【实验前准备】
（1）材料待检测的RNA及制备好的探针。
（2）设备电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X线片，杂交袋，硝酸纤维素膜或尼龙膜。
（3）试剂20×SSPE：175．3g NaCl，88．2g柠檬酸钠，溶于800ml水中，用10mol／LNaOH调pH至7．4，定溶到1L。其他试剂：与southern杂交试剂类似，只是所有的试剂均应用DEPC处理。
【操作步骤】
（1）RNA经变性电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA转移至硝酸纤维素滤膜上。转移方法与转移DNA的方法相似。
（2）转移完毕后，以6×SSC溶液于室温浸泡此膜5min，以除去琼脂糖碎片。
（3）将该杂交膜夹于两张滤纸中间，用真空烤箱于80℃干燥0．5～2h。
（4）用下列两种溶液之一进行预杂交，时间为1～2h。若于42℃进行，应采用50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt’s试剂，0．1％SDS；若于68℃进行，应采用：6×SSC，2×Denhardt’s试剂，0．1％SDS，（注意：BLOTTO不能用于Northern杂交）。
