基因芯片是分子生物技术、机械制造技术、计算机技术等学科的交叉、结合，它通过像集成电路制作过程中半导体光刻加工那样的微缩技术，将现在生命科学研究中许多不连续的、离散的分析过程，如样品制备、化学反应和定性、定量检测等手段集成于1cm（上标2）。大小的基片（硅片、玻璃和尼龙膜等），在上面固定核酸、蛋白及多肽序列等大量探针分子，形成高密度点阵，与样品中的靶分子作用后，通过分子杂交技术在相同条件下进行反应，反应结果用同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或激光共轭聚焦（CCD）摄像技术记录，由计算机进行分析、综合，并使这些分析过程连续化和微型化，显示出快速、高效率、高通量处理生物学信息的能力。
一、基因芯片技术原理及分类
基因芯片又称DNA芯片，属于生物芯片的一种。其工作原理是：经过标记的待测样本DNA通过与芯片上特定位置的探针杂交，可根据碱基互补配对的原则确定靶DNA序列，经激光共聚集显微镜扫描，以计算机系统对荧光信号进行比较和检测，并迅速得出所需的信息。基因芯片技术比常规方法效率高几十到几千倍，可在一次实验中间平行分析成千上万个基因，是一种进行DNA序列分析及基因表达信息分析的强有力工具。
该技术本质上与Southern bloting和Northern bloting相同，只是许多探针同时固定在同一芯片上，在相同的实验条件下，同时完成多种不同分子的检测。因此它和传统杂交法相比具有操作简单、效率高、成本低、自动化程度高、检测靶分于种类多、结果客观性强等明显的优点。它与其他基因表达谱分析技术，如RNA印迹（Northern blot）、cDNA文库序列测定、基因表达序列分析等的不同之处在于，基因芯片可以在一次实验中同时平行分析成千上万个基因。如果标本中有目标分子，则产生荧光信号且信号强度与目标分子数量成一定的线性关系。
基因芯片分类方法有多种，根据其制造方法可分原位合成法和合成后点样法；根据所用载体材料不同分为玻璃芯片、硅芯片等；根据其用途可分测序芯片、表达谱芯片、诊断芯片等。近年来，已研究开发出以各种结构微阵列芯片，如生物电子芯片、药物控释芯片；通道型微阵列芯片、基因扩增芯片、集成DNA芯片和生物传感器芯片等。
最常用的是按载体上所点探针的长度分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片两种。
（1）cDNA芯片由schena建立，将特定的cDNA经PCR扩增后借助机械手直接点到基片上。
（2）寡核苷酸芯片由Fodor首先报道，用照相平板印刷术和固相合成技术在基片上生成寡核苷酸，分为长寡核苷酸芯片和短寡核苷酸芯片，与cDNA芯片制作的一个主要不同点是多一步转录获得cRNA的过程。几种基因芯片技术的比较见表5—2。关于不同基因芯片技术的灵敏度和特异性仍存在争议。起初。人们认为长寡核苷酸芯片和cDNA芯片有更高的特异性和灵敏度。现在看来，短寡核苷酸芯片同样有效和特异，因为每一个基因代表11～20个寡核苷酸。
表5－2几种基因芯片技术的比较
项目cDNA短寡核苷酸芯片长寡核苷酸芯片
探针长度05～3kh 15～20bp 45～70bp
mRNA＋＋＋＋＋＋
区分基因型－＋＋＋
检测剪接变异体－＋＋＋＋＋
点阵一致性－＋＋＋＋＋
目前应用＋＋＋＋＋＋
批量生产一致性－＋＋＋＋＋＋＋
芯片成本适中较高轻微
为提高芯片杂交的准确性，出现了肽核酸芯片（PNA microarray），肽核酸是以中性酰胺键为骨架的一类新的DNA类似物，对核酸有着独特的序列识别功能，它不带电荷，与核酸杂交时不存在静电排斥作用，故PNA与互补的DNA或RNA杂交时，比类似的DNA寡聚物有着更高的亲和性，而且PNA很稳定，对提高基因芯片的检测效果，防止假阳性方面有一定的进步。
流过式芯片是美国开发的一种微通道芯片，它将寡核苷酸探针结合于微通道内的特定区域，然后让使荧光标记后的样品流过该区域，以完成探针与模板的杂交，该芯片检测灵敏度高，反应速度快，芯片可反复使用多次，因而其成本较低。
二、基因芯片技术的关键技术环节
基因芯片技术主要包括4个基本环节：芯片制备、样品的制备和标记、杂交反应以及信号的检测和分析。
1．芯片制备
主要是原位合成法和点样法。原位合成法适用于寡核苷酸；点样法多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸。原位合成法包括光导合成法和压电合成法。其优点是反应量大，探针的密度高并且可以和其他芯片制备方法结合使用，该方法的缺点是探针的长度较短，一般为20～50bp。点样法包括接触式点样和非接触式点样又称喷墨式打印。因点样法成本高，故适用于芯片上需要同一探针或是探针是长链DNA。高密度寡核苷酸芯片制备主要采用原位合成法，低密度芯片则采用点样法。
（1）原位合成法是由美国Affymetrix公司首先开发，利用固相化学、光敏保护基及光刻技术得到位置准确、高度多样化的化合物集合。在合成前需要先对介质进行处理，使之衍生出羟基或氨基，并用光敏保护基团将其保护起来，合成所用的单体分子3＇端用固相合成法活化，5＇端用光敏保护基保护，在合成过程中，通过避光膜使特定的位点透光，其余的位点不透光，只有受光的位点才能脱掉保护基并与特定单体相连，合成的第一步是利用光照射，使介质表面上的羟基脱保护，然后介质表面与光敏保护基保护、亚磷酰氪基活化的碱基单体接触，一个5＇端被保护的核苷酸单体就连接上去，反复这个过程，直到合成一段所需长度的寡核苷酸为止。
（2）原位喷印合成芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制备的化学试剂。
（3）直接点样法主要有以下几种：①点接触法，由Shalon等建立，其密度可达到10 000／3．6cm（上标2）。该方法是在片基以外，事先合成好寡核苷酸探针，然后利用共价键连接到片基上。连接主要有以下几种方法：硅烷化寡核苷酸探针直接点样于玻片上制成寡核苷酸微阵列；硫代寡核苷酸探针通过二硫键与巯基修饰的玻片连接；氨基修饰的玻片与5＇末端带氨基的寡核苷酸探针通过共价键连接；丙烯酰胺硅烷化的基片与5＇－丙烯酰胺修饰的寡核苷酸探针连接。②喷墨法，由美国Icy Pharmaceutical公司开发，其原理类似喷墨打印机，即将事先合成好的寡核苷酸探针喷射到基片上指定的位置来制作DNA芯片，即为喷墨式打印法。其密度可达1000D／cm（上标2）。微点样法中探针的固定是一个重要环节，目前固定探针的方法较多，主要通过寡核苷酸和载体之间的共价交联或静电作用吸附。此外，目前还发展了一些较有特色的芯片，它们的制作方法也略有区别，如三维芯片是在一块载玻片上固定了10 000个聚乙烯酰胺凝胶微条，每个微条均可用作生物分子分析，增加了反应的敏感性，并且在芯片上可同时进行扩增与检测。
2．样品制备与标记
靶基因的制备和标记是基因芯片技术流程的一个重要环节，靶基因在与芯片探针结合杂交之前必须进行分离、扩增及标记。标记方法根据样品来源、芯片类型和研究目的的不同而有所差异。通常是从待检细胞或组织中分离出DNA或RNA，也可采用常规的分子生物学手段，如PCP扩增DNA片段；RT－PCR获得的cDNA；cDNA文库中获取的单一、纯化的cDNA；基因克隆技术获取的DNA；人工合成的DNA等；经逆转录、PCR扩增、末端标记等操作，标记主要有荧光标记、生物素或同位素标记。对于检测细胞内mRNA表达水平的芯片，一般需要从细胞和组织中提取RNA，进行逆转录，并加入耦联有标记物的dNTP，从而完成对靶基因的标记过程。
