聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术，是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸（DNA或RNA）扩增技术，最早是Khorana于1971年提出这个设想。美国科学家Kary Mullis等在1985年实现了这个梦想，发明了具有划时代意义的PCR技术。
PCR基本原理是在模板DNA、引物、4种脱氧核糖核苷存在的条件下，体外模板依赖于DNA聚合酶的DNA酶促反应过程。扩增DNA片段的特异性是由引物与模板DNA结合的特异性所决定的。PCR反应是由变性、退火、延伸等3个连续步骤周而复始反复、循环的过程组成。
PCR技术已经发展成包括定量PCR、纳米PCR、PCR芯片、重组PCR、原位PCR和荧光定量PCR等技术的大家族，以下就基本的PCR技术、常用的PCR技术如原位PCR、重组PCR、免疫PCR和荧光定量PCR进行介绍和说明。
一、基本的PCR技术
（一）PcR反应中的丰要成分
1．引物
PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：①引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。②引物中G+C含量通常为40％～60％，可按下式粗略估计引物的解链温度Tm=4（G+C）+2（A+T）。③四种碱基应随机分布，在3′端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。④引物3′端最好与目的序列阅读框架中密码于第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。⑤在引物内，尤其在3′端应不存在二级结构。两引物之间尤其在3′端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。⑥引物5′端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结台位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5′端限制酶位点外再加1～2个保护碱基。引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构，以免产生非特异性扩增，影响产量。⑦简并引物应选用简并程度低的密码子，例如选用只有一种密码子的Met，3′端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。一般PCR反应中的引物终浓度为0．2～1．0μmol／L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。利用紫外分光光度计，可精确计算引物浓度，在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：
X（mol／L）=OD260／A（16000）+C（70000）+G（12000）+T（9600）式中，X为引物摩尔浓度，A、C、G、T为引物中4种不同碱基个数。
2．4种三磷酸脱氧核苷酸［dNTP］
dNTP应用NaOH将pH值至7．0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5～10mmol／L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20—200μmol／L。理论上4种dNTP各200μmol／L，足以在100μl反应中合成2．6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmoL／L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
3．Mg2+上标
Mg2+上标浓度对TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+上标浓度范围为0．5—2mmol／L。对于一种新的PCR反应，可以用0．1—5mmol／L递增浓度的Mg2+上标进行预实验，选出最适的Mg2+上标浓度。在PCR反应混合物中，应尽量减少高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+上标离子浓度的物质，以保证最适Mg2+上标浓度。
4．模板
PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链或双链分子，可以是线状或环状分子（线状分子比环状分子的扩增效果稍好）。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为10的平方～10的5次方个拷贝，对于单拷贝基因，需要0．1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精于提取的DNA中分析目的序列，模板量过多则可能增加非特异性产物，DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
5．Taq DNA聚合酶
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92．5℃130min，95℃40min，97℃5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min掺入10nmol／L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10的-4次方核苷酸／每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。在100μl PCR反应中，1．5～2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环，所用的酶量可根据DNA、引物及其他因素的变化进行适当的增减，酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活Taq DNA聚合酶，灭活Taq DNA聚合酶的方法有：①PCR产物经酚、三氯甲烷抽提，乙醇沉淀；②加入10mmol／L的EDTA螫合Mg2+的上标；③99～100℃：加热10min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。
6．反应缓冲液
反应缓冲液一般10—50mmol／L Tris·cl（20℃下pH 8．3～8．8），50mmmol／L KCl和适当浓度的Mg2+的上标。Tris·CL在20℃时pH为8．3—8 8。但在实际PCR反应中，pH为6．8—7．8。50mmoL的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mmol／L的二硫苏糖醇（DDT）或100μg／ml的牛血清白蛋白（BSA），它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
（二）PCR反应条件
PCR反应包括三个基本步骤。
（1）变性（denature）目的双链DNA片段在94℃下解链。
（2）退火（anneal）两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对。
（3）延伸（extension）在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25—35轮循环就可使DNA扩增达10的6次方倍。
1．变性
在第一轮循环前，在94℃下变性5～10min非常重要，它可使模板DNA完全解链，然后加入Taq DNA聚合酶，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量，一般变性温度与时间为94℃1min。在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列，可适当提高变性温度，但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
2．退火
引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量高，长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并，只用两种温度（例如用60℃和94℃）完成整个扩增循环，既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37～55℃，1—2min。
3．延伸
延伸反应通常为72℃，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20—85℃。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度，在一般反应体系中，Taq DNA聚合酶每min约可合成2kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加，但对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间（10～30min）的延伸反应，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
4．循环次数
当其他参数确定之后，循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25—30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25～30轮循环扩增后，反应中Taq DNA聚合酶已经不足，如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释10的粒方—10的5次方倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60轮循环后，扩增水平可达10的9次方～10的10次方。扩增产物的量还与扩增效率有关，扩增产物的量可用公式C=C0（1+P）的n次方表示。其中：C为扩增产物量，Co为起始DNA量，P为增效率，n为循环次数。在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。甲合期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。
（三）PCR基本操作方法
【实验前准备】
（1）材料不同来源的模板DNA。
（2）设备移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪，琼脂糖凝胶电泳所需设备（电泳槽及电泳仪），台式高速离心机。
（3）试剂10 x PCR反应缓冲液：500mmol／L KCL，100mmol／L Tris·CL在25℃下，pH9．0，1．0％TritonX—100．MgCL2的下方：25mmol／L。4种dNTP混合物：每种2．5mmol／L。Taq DNA聚合酶5U／μl。其他试剂：矿物油（石蜡油），1％琼脂糖，5×TBE，酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1），无水乙醇和70％乙醇。
【操作步骤】
（1）PCR反应
①依次混匀下列试剂：35μl H（2下标）O，5μl10×PCR反应缓冲液，4μl 25mmol／LMgCl（2下标），4μl4种dNTP，0．5μl上游引物（引物1，10mmol／L），0．5μl下游引物（引物2，10mmol／L），0．5μl模板DNA（0．1—1μg），混匀后离心5s。
②将混合物在94℃下加热5min后冰冷，迅速离心数秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0．5μl约2．5U），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
③用94℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，循环35轮。最后一轮循环结束后，于72℃10min，使反应产物扩增充分。
（2）PCR反应产物的检测琼脂糖电泳：取琼脂糖1g，加入100mL1×TAE，缓冲液，制备1％琼脂糖凝腔，在微波炉或水浴中琼脂糖加热溶解，倒胶前使琼脂糖冷却至60℃。加入溴乙锭，晃动混合，不要有气泡。插入样孔梳，将琼脂糖倒入封好的平板上。待腔凝固成白色不透明状，轻轻拔出梳子。将胶板轻轻放入电泳槽内。取PCR扩增产物8μl，加2μl上样缓冲液，混匀后上样，100V，电泳30min，紫外灯检查反应产物，根据分子量标记物判断扩增物的大小。
【注意事项】
（1）PCR非常灵敏，操作应尽可能在无菌操作台中进行。
（2）吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换，不要互相污染试剂。
（3）加试剂前，应短促离心10s，然后再打开管盖，以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
（4）应设含除模板DNA外其他所有成分的负对照。
二、原位PCR技术
原位PCR技术是将检测细胞内特定基因的原位杂交技术和聚合酶链式反应（PCR）法相结合的一种分于生物学技术，可在组织切片或整个细胞上检测单复制或低复制的核酸样品，兼具两者的优势，具有特异性强、敏感度高、定位准确的特点。
原位PCR技术不仅可以用于检测细胞或组织中微生物病原的核酸，还可以分析肿瘤、遗传性疾病等内源基因的变化，以及跟踪疾病与治疗过程带来的基嗣组改变，在分子水平上阐明疾病发生发展与致病因子之间的相互作用，在病理学研究与诊断中得到越来越广泛的使用。
1．原位PCR的原理
是将组织切片或细胞铺在载玻片上；检测mRNA时先使之逆转录为cDNA，将PCR溶液滴于组织切片上，置于thermal cycler（热循环PCR仪）中进行扩增。扩增产物可以利用特异探针进行杂交检测。
2．原位RT—PCR的主要步骤
（1）组织前处理保持组织形态，保存核酸完整性非常重要。一般使用置于载玻片上的冰冻切片、培养细胞、石蜡切片等。
（2）逆转录以全部RNA为逆转录的模版合成cDNA。
（3）PCR利用专门的衬垫将PCR溶液（Taq聚合酶、棱苷酸、primer sets、缓冲液）置于组织切片上，在thermal cycler中进行反应。
