（6）多块组织和碎组织包埋于一个蜡块内时，组织的排列一定要紧密靠拢，以求成直线或方块，这样有利于切片。
（7）石蜡包埋后，不宜冷凝过慢，特别是室温较高时，石蜡凝固后应立即投入冷水加速冷却可增加石蜡韧性和硬度。冷凝过速也会因为内外温差过大造成蜡块裂损。
六、石蜡切片的制作
以石蜡制作的切片，可以制成极薄的切片。一般的切片厚度要求在4～6μm，石蜡切片甚至可以切得更薄，达到2μm以至1μm。这一点是冰冻切片和火棉胶切片难以获得的结果。另外，石蜡切片还便于制作大批的或是连续的切片，组织块便于长期保存。所以石蜡切片是目前各种切片制作方法中最普遍的一种方法。
（一）切片前的准备
（1）恒温水浴锅首先预热至35—40℃。
（2）蜡块整修，将蜡块组织面的石蜡用刀修去，使组织全部暴露出切面并修平，以减少切片刀的磨损。将组织块左右两侧的石蜡在不损伤组织及影响诊断的原则上，全部切除；否则切片容易皱褶。组织块上下边缘的石蜡视组织情况修齐修平。修切蜡块时只能一点一点地切掉蜡边，防止大片修切蜡块断裂露出组织，如遇此情况应返入新蜡再次包埋。
（3）载玻片应事先洗涤干净，无油腻和不透明现象，应将载玻片浸入酸缸内12h后流水冲洗，再烤干备用。
（4）将锋利的刀片装入切片刀夹钳内，调整角度和位置后随即紧固，检查切片刀的倾斜度是否正确，倾角过大、则切片上卷；倾角过小则切片皱起，以20度～30度为佳。
（5）备用小型毛刷、小型无钩镊子、铅笔。
（二）切片的步骤
（1）将蜡块固定于切片机头上的夹座内，调整到稍离开切片能够切到的位置上，注意蜡块组织切面与切片刀口要垂直平行。
（2）再调整蜡块组织切面恰好与刀口接触，旋紧刀架，固定好机头。
（3）根据需要调整切片厚度，摇动切片机手轮先进行修整切片，直到切出完整的最大组织切面后，再进行切制。
（4）实践中可用右手转动切片机手轮，左手用毛刷托起蜡片。协调地进行切片操作。
（5）切下的切片带，一端用镊子轻轻拉起，应尽可能将切片带拉直展开，用毛刷将切片带乩刀口向上挑起，拉下切片带，然后轻拖铺于恒温水面上。
（三）贴片
（1）将单张或数张切片，用镊子夹住蜡片的一边并提起，铺于恒温水中，（光亮的一面朝下）立即用镊子轻轻拉展以切片无皱褶为最好。如有皱褶时用镊子细心地逐个轻轻拨开，注意不可拨破组织。然后分开每张切片，选取其中最完整的，没有皱褶的切片。
（2）待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中，并用镊子将切片一边拨于玻片上，随即将玻片直立提起，拨正切片位置。如组织较小，可在玻片上多贴几片或几排，但排列应密集、整齐。
（3）用铅笔在玻片一端的毛玻璃上写上标本编号，字要写得小而清楚、端正。
（4）将贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2h，蛋白质凝固后即可进行染色。
（四）切片的注意事项
（1）切片质量的好坏，除与技术熟练程度和切片机的好坏有关外，切片刀是决定的因素，所以刀一定要磨得十分锋利。否则在切片时会自行卷起或皱起，或将组织划伤出现刀痕，更不能顺利地将切片切成连续地长条带状。
（2）切片机的各个零件和螺丝应旋紧，否则将会产生震动。在每次更换蜡块时，应习惯地检查一下组织块是否夹紧，切片刀是否稳固。在切片的开头阶段如出现切制不良与其他故障，最常见的原因是蜡块或切片刀的松动所致。
（3）在摇动切片机时，用力要求均匀一致，不宜过重过猛，否则可因用力过重而使机身震动，造成切片厚薄不均。遇有硬化过度的脑、肝、脾等组织时，更应该轻轻切削，以防组织由于震动形成空洞现象。
（4）在夏秋季节进行切片时，应使用冰块加强冷却，这样不仅可保持石蜡的硬度，同时也减少了切片的褶皱，给切片制作带来方便。
七、石蜡切片的异常及处理
一张理想的切片，除组织固定适当和染色清晰之外，还应具备：薄，平整，无皱褶压缩，无裂损抓迹及擦痕，同时贴片排列密集、整齐，透明度好，封片用胶适量，盖玻片端正，无气泡等。切制困难主要有两种情况：①组织太硬；②切制时组织易碎（如皮肤、骨骼或血凝块）。
（一）影响切片质量的因素（表4—26）
表4—26影响切片质量的因素
_________________________________________________________________
制片程序影响因素
_________________________________________________________________
取材组织形态不规则，过大，厚薄不均
_________________________________________________________________
组固定固定不及时；固定液选择不当
织脱水脱水不良；或时间过长
的透明透明过长；或透明不足
处浸蜡时间不当；石蜡质量不纯，熔度选择不当
理包埋石蜡的硬度；组织位置安排不当；包埋不平、碎组织散乱
_________________________________________________________________
切片刀不够锋利，刀身角度固定不当
切切片机性能掌握不够，保养不当
片技术熟练程度不够
_________________________________________________________________
（二）石蜡切片中的异常及原陶和处理方法（表4—27）
表4—27石蜡切片中的异常及原因和处理方法
_____________________________________________________________________________________
异常表现原因和处理方法
1．刀刃损；需磨
切片纵裂或纵断2．刀口黏附细丝；需擦净刀口
3．组织内有细小过硬异物或骨质等；剔除异物，骨质脱钙
_____________________________________________________________________________________
1．切片机调整螺旋；需紧固
切片厚薄不均，宽窄相间2．组织过硬；需用软化剂处理，湿润组织切面，稍冰冻，均匀而慢切
3．刀的倾角过大；需调整
_____________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
异常表现原因和处理方法
__________________________________________________________________________
1．组织形状不规则，蜡边缘区不平行并与刀刃不平行
2．由于阻力不同，切片带组织内成分复杂，向阻力小的方向弯曲；
修蜡块应视组织情况将蜡块切修成倒梯形，阻力大的一侧窄，小的
一侧宽
切片带呈弧形弯曲3．切片过厚，刀角偏大，刀钝；需磨调整厚度及刀角，选择锋利切片
__________________________________________________________________________________
1．蜡块被压缩，系由于刀刃斜面不平；需研磨、鐾刀
切片变窄，切片周围蜡边2．组织内纤维成分过多；应细心处理组织
粘连使褶皱不易展开3．组织浸蜡不足，石蜡硬度不够，室温过高；冰蜡块或选换硬蜡
4．组织块不必要的过大
__________________________________________________________________________________
间歇出片刀座、蜡块固定过松；需旋紧螺旋
__________________________________________________________________________________
1．蜡块组织双侧留有蜡边；切片前组织两侧石蜡全部切除
2．组织厚薄不均脱水变形，包埋不平；取材时注意厚薄均匀，注意组织
组织褶皱脱水处理，包埋要平整
3．碎组织包埋时排列不整齐，密集、组织成分较复杂；包埋应将碎组织
排列密集整齐，切片水温不宜过高，摊片后尽量缓缓拉展
_____________________________________________________________________________________
1．刀钝；需磨
组织破碎2．蜡太软；需用冰块处理蜡块切面
3．蜡内形成冰晶，凝固时冷却得慢或含水及透明剂；需重新脱水
4．温度过高使组织变硬变脆；先用温水浸润而后切
_____________________________________________________________________________________
切片贴在1．刀钝；擦净刀口，选锋利处切
蜡块上2．组织内纤维成分过于集中（如皮肤），消化道组织切片时将皮下组织或
切片不成带浆沫置于下面
__________________________________________________________________
切片贴于1．卷刀、磨刀
刀口2．刀口黏附石蜡过多，擦净刀口
______________________________________________________________________________________
切制石蜡切片遇到障碍大多数是：①刀钝或刀刃受损；②蜡块或切片刀的调整螺旋或是紧固螺旋拧不紧。因此，有经验的切片者在切片之前应习惯地反复核查这两点。
八、苏木素—伊红染色法
（一）苏木素—伊红染色的基本原理
苏木素是最早用于生物学上的天然染色剂之一，一直是生物学实验室最常用的组织学中细胞核的染料，它是从苏木树的树心中提炼出来的，为浅褐色结晶或淡黄褐色的粉末状物。易溶于乙醇、丙三醇，也可溶于热水。苏木素本身段有染色能力，它经过氧化后，能产生具有染色能力的苏木红，苏木又称为氧化苏木素或苏木因。
成熟的苏木素对组织可无亲和力，需加入含金属离子的媒染剂，才能达到染色的目的。一般用明矾苏木索的媒染剂为钾明矾或氩明矾。主要是利用明矾中的铝离子和苏木红结合形成的铝沉淀色素为紫蓝色，对染色质有很大的亲和力，水和乙醇都不能使其褪色。
常规苏木索染色的对比染色是伊红，苏木素一伊红染色，简称HE染色，是一种在组织病理学中使用最为广泛的常规染色方法。一张优质的染色切片，可以清晰地观察到各种不同的组织结构以此作为病理诊断的确切依据。
（二）石蜡切片HE染色法的基本步骤
（1）二甲苯I10min。
（2）二甲苯II（应完全透明）10min。
（3）无水乙醇（变为不透明）1—2min。
（4）95％乙醇1～2min。
（5）80％乙醇1—2min。
（6）苏木素液染核10～15min。
（7）自来水洗片刻。
（8）1％盐酸乙醇分化数秒。
（9）流水冲洗，蒸馏水反蓝10min。
（10）复染0．5％伊红水溶液（对比染色）2～5min，（若为醇溶伊红可直接入90％乙醇）。
（11）自来水洗（分化伊红）片刻。
（12）80％乙醇1～2min。
（13）90％乙醇1～2min。
（14）95％乙醇1～2min。
（15）无水乙醇I1～2min。
（16）无水乙醇II1～2min。
（17）二甲苯I 5～10min。
（18）二甲苯II5～10Min。
（19）盖玻片下封固。
结果：胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈橘红色，其他成分呈深浅不同红色。
（三）染液的配制
1．苏木素染液
配方：
甲液：苏木素1g，无水乙醇10ml
乙液：硫酸铝钾20g，蒸馏水200ml
丙被：氧化汞0．5g
经典的配制方法是，先将甲液溶解，待用，再将乙液加热溶解至沸，去火，待溶液仍处于小沸腾状态时再将甲液徐徐倾入其中，全部混合后，再使溶液在短时间内加热至沸腾，去火，最后，将氧化汞缓慢倾入溶液中（氧化汞一定要慢慢少量分次加入，切忌急躁），此时液体变为深紫色，待氧化汞全部放入后，再将溶液加温至沸腾片刻，立即将溶液放人流动的冷水中，并缓缓地连续摇晃至溶液完全冷却为止。隔夜后过滤，加入冰醋酸（按5％比例）混匀，再过滤后保存于冰箱内备用。
2．伊红染液伊红为砖红色粉末状或酱红色结晶，是最常用的胞浆染料。又名曙红，它是荧光黄的四溴衍生物。曙红本身溶于醇而不溶于水，也称为醇溶性伊红，它的钠盐、钾盐或铵盐可溶于水，因此称为水溶性伊红。
配方：
伊红Y（水溶性）0．5g，加蒸馏水至100ml。
伊红Y（醇溶性）0．5g，加80％乙醇至100ml，加入冰醋酸1～2滴。
（四）染色注意事项
一张优质的HE染色切片，绝非仅指染色而言，它包括很多方面，首先应重视固定环节，其次注意脱水、透明、组织浸蜡，包埋和切片等各个步骤。一张因固定、脱水等步骤有所缺陷的切片，染色是不可能鲜艳、透明、层次分明的。上述问题的解决方法已在静面提及。HE染色时应注意以下问题。
（1）组织切片的脱蜡应彻底，脱蜡时间要充分，否则无论进行哪种染色都会发生困难。若室温过低，可将溶蜡剂置于温箱中进行脱蜡。
（2）苏木索染渡使用一般时间后表面易出现亮晶状漂浮物，这可能是液体表面的过氧化物，必须过滤除去，以防沉渣污染组织切片。苏木素液一般染过三四百张切片后，着色力会减弱，着色不鲜艳，呈灰蓝色时应及时更换新液。
（3）染色时间的控制，染色时间的长短需根据染色剂对组织的染色作用、室温条件、切片厚薄、固定液的类别和染渡的新旧而调节。
（4）分化十分重要。分化步骤的准确是染色成败的关键，若分化不当则引起染色不匀或过淡、过深等现象，因此分化后定要镜检，观察胞核是否清晰，胞浆呈淡白色。
（5）伊红宜淡染，复染过深胞核会不清晰，影响镜检。
（6）若脱水、透明等步骤不够彻底，则组织表面会有一层雾状膜。若有此现象，应立即更换无水乙醇脱水，再次透明。在潮湿的季节里应注意乙醇的浓度，及时更换。
（7）封固剂要适量，滴加时应小心倾滴，盖玻片要轻轻放置，以免气泡产生。盖玻片大小选择要合适，一般要大于组织块，以防封盖不全，盖玻片要放正，标签贴牢，编号清楚。
（8）染好的切片应妥善保存，避免日光照射，否则切片容易褪色。
（五）封固剂
常用无水封固剂：如中性树胶、大马树脂及人工树脂等。用于石蜡、冰冻和火棉胶切片的封固，使用时组织切片必须脱水、透明彻底，否则片中会出现云雾状混浊，影响镜检。通常这些封固剂系将一种树脂（天然或合成的）溶于二甲苯内直至呈适当的流体状以便封固。其黏稠度以易排除气泡且在盖玻片与切片之间能自由流动为好，稍稠一点则可避免干燥后在盖玻片下形成空气间隙。
选择一种封固剂，应以对所用的各种染色剂不褪色为原则。封固剂还应具有准确的折光率。染色的切片以折光率在1．52—1．54之间的封固剂封固透明度最佳。我们常用的无水封固剂为市售的中性二甲苯树胶液，亦称中性树胶；为无色或淡黄色的透明液体，因酸或碱性封固剂均可引起组织切片的褪色，故宜用中性封固剂。封固剂应保存于有色瓶中避免目光照射，并存放于暗处以防酸变。用以封存HE染色的切片色彩非常鲜艳。凝固后即变硬，能把盖玻片和载玻片紧紧地粘在一起。仅有的缺点是随着保存时间的延长，树胶逐渐使二甲苯氧化，产生甲苯酸及邻苯二甲酸，能使碱性染料褪色。
