5％的甲酸是一种良好的常规脱钙剂，速度适当，组织损害小。当甲酸增至25％，则增快脱钙速度，加入甲醛可适当保护组织不受酸损害。根据组织的厚度和钙化程度，5％甲酸液2～4天可完全脱钙，横切的肋骨需36—48h。
2．含盐酸脱钙液Von Ebner液：配方为浓盐酸15ml，氯化钠7．5ml，蒸馏水加至100ml。
盐酸脱钙易使组织收缩，作用速度较快，用氯化钠作为溶剂则效果良好，牙齿脱钙时盐酸可增至10％～20％。脱钙时，每日应加盐酸（0．5％）直至完成脱钙，横切的人肋骨（5mm厚度）于36—72h内脱钙。
3．硝酸脱钙洼
硝酸脱钙液是最常用的脱钙剂，其缺点是形成亚硝酸而使溶液呈黄色，产生颜色即迅速影响脱钙速度，且组织的黄染会妨碍随后的染色反应。在硝酸内加入0．1％尿素可以防止变黄而使之无色，但尿素仅有暂时作用，一旦硝酸显淡黄时需要加入。
（1）福尔马林一硝酸液（Clayden液）配方为福尔马林5ml，硝酸（比重1．41）7．5—15ml，蒸馏水加至100ml。
此处方中甲醛可部分地抑制硝酸的浸软作用，这既有脱钙作用，又具有固定作用，硝酸脱钙迅速，组织不膨胀，掌握好脱钙时间可直接脱水，不影响染色效果。但盛好先洗去硝酸。
（2）硝酸水溶液配方为硝酸5～10ml，蒸馏水加至100ml。
此液用作常规脱钙剂，作用迅速，对组织不膨胀，对细胞的保存和染色比前者更好，能通用多种染色技术，但每日需要更换新鲜溶液，最好早晚各一次，一般1～3天完成。
（二）螫合剂脱钙
乙二胺四乙酸（EDTA）是用以脱钙的螯合剂，有结合某些金属的能力，能结合钙盐，15％的溶液即起脱钙作用，组织用此方法脱钙，对组织破坏性小，放置数月也不致引起对组织的破坏，对大多数的染色技术皆可得到满意结果。经10％中性福尔马林固定后，将组织移到5．5％EDTA内。不超过5mm厚度的小块组织在此液内每4—5天换液一次。完全脱钙后将组织直接移到70％乙醇内常规脱水、浸蜡、包埋。
（三）脱钙步骤
（1）取材骨组织固定于1O％甲醛24h后再锯取厚度约0．5cm骨片。
（2）固定再以10％中性福尔马林固定2大。
（3）将组织置于脱钙剂中，每日更换新鲜液，直至组织软化为止。
（4）流水冲洗24h（除酸）。
（5）进行常规脱水，透明，浸蜡，切片。
（四）鉴定脱钙是否彻底
确定脱钙“终点”有三种方法。
（1）最常用最简单的方法—针刺，如果很容易被刺透，而且不感到阻力时，说明组织基本上脱钙完全，否则应继续脱钙。靠组织的柔软性测验脱钙作用靠不住，而且这种插入一根针以察觉钙沉键的方法会造成组织损伤。
（2）用x射线检查看组织内是否仍有钙质。
（3）用化学实验检查取5ml脱钙液用2mol／的氢氧化钠调整至中性，再加5％草酸钠或草酸铵1ml，液体混浊表示有钙质。至5min仍不混浊表示脱钙液中不含有钙质。组织中仍有钙质时，一定量的钙离子会溶于脱钙液中，游离的钙会干扰脱钙作用的完成。显然，应在每次实验时完全更换，再实验中必须经过2～3h间隔让钙溶解。
（五）酸的中和
脱钙后水洗24h，目的是除去组织中经无机酸浸渍后过多的酸，以免影响染色。在冲洗前应将组织用碱处理以使之脱酸呈中性，可用5％硫酸钾或硫酸钠处理过夜。但直接转移到70％乙醇内12～18h换液2次，再继续脱水、透明、石蜡包埋、切片，在多数情况下不仅不膨胀且对染色反应能有所改善。因此不冲洗对染色也没大碍，只是脱水剂被酸化。
四、脱水
（一）脱水
制作石蜡切片前需将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡是不相混合的。所以在浸蜡前必须将组织内所含的水分脱去。而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先脱水。
脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比倒下均能混台的液体。
常用的脱水剂：
（1）乙醇是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下混合，乙醇的脱水能力比较强，又能硬化组织。但是乙醇的穿透速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。因此以乙醇作为脱水剂时，应该从低浓度开始，然后递增，这样可以避免组织过度收缩。
一般情况下，组织经过70％、80％、90％、95％以至无水乙醇的脱水程序，即可达到脱水的要求。但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次100％乙醇重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。脱水时间应视组织种类，组织块大小，厚薄和固定剂的不同而异。用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水乙醇内，但应多次换液以除酸。
乙醇脱水剂使用不宜太久，应适时更换新液。当乙醇混浊，变黄或乙醇滴于水中出现乳白色混浊时，说明乙醇中溶解了过量的脂类，这种情况会影响脱水，则应及时更换。如果组织脱水不尽，随后的透明、浸蜡都会受到影响，致使切片难以完成。较差质量的切片，很容易造成在染色时脱片。这样的组织蜡块，因其含有一定的水分，一经与空气接触即干燥而凹陷。常规标本的制作。目前都采用快速脱水的方法。科研和教学标本的脱水时间比较长，其目的在于更充分脱水，并适当加强了组织的硬度。
切片室内应常备有70％、80％、85％等各种浓度的乙醇。配制时应以95％乙醇作为基液加水稀释，不要用无水乙醇去配制，因无水乙醇的价格较高，极不经济。
（2）丙酮可用作固定液，也是一种比较好的脱水剂。脱水能力强、速度快，可配制不同浓度进行脱水。但一般情况下，多用在无水乙醇的补充脱水。丙酮脱水时间比乙醇强，但容易使组织过度硬化，所以应适当掌握脱水时间。
（3）正丁醇正丁醇脱水能力较乙醇弱，可与水、乙醇相混合，也能溶解石蜡，因此正丁醇不仅可以替代乙醇脱水，还可以代替二甲苯使组织透明。平常在稀释时都与乙醇按照一定比例配制使用，或将组织脱水至90％乙醇后移入正丁醇。用正丁醇脱水，组织比较少引起收缩和硬化等不良结果。
（二）透明
组织脱水后，还要经过一个浸蜡透明过程。目的是使石蜡渗透到组织中去，达到包埋的支持作用。常用的脱水剂（如乙醇等）不能溶解石蜡，因此必须使用一种既可以同乙醇又能同石蜡相混合的溶剂，当组织脱水后，浸蜡之前将组织投入这种溶剂中。由于两种溶剂能相混合，另一方面也由于这种溶剂比乙醇比重大，组织中的乙醇就被该溶剂取代，组织即成透明状态，因此我们常称这种溶剂为透明剂，在制片中的这一过程就称为透明。
实质上透明仅是一种过程而非目的，出现透明现象是因其折光系数改变的缘故。从组织的状态上看，由于组织经过媒剂的作用之后，其折射系数近于组织蛋白的折射系数，从而展示出透明状态。组织一旦呈现透明状态，说明脱水剂已被透明剂所取代。
透明剂很多，一般常用的有二甲苯、苯、甲苯、三氯甲烷、香柏油等。这里只介绍常用的三种。
（1）二甲苯是最常用的一种透明剂，它能与乙醇、丙酮相混合，又是石蜡的溶剂。在透明过程中，组织继续发生硬化，由于二甲苯对组织的收缩性强，作用迅速，因此组织在二甲苯中时间不宜过长，否则容易变脆变硬，一般是达到组织的透明为度，小块组织在0．5～1h内透明。为了防止组织过度硬化，苯则是一种更好的透明剂，它较甲苯和二甲荦的作用稍缓，对组织收缩较步，不易变脆。但苯较二甲苯毒性大，挥发快，故使用时应注意安全。
（2）三氯甲烷（氯仿）三氯甲烷也是一种很好的媒剂，它的作用缓和。组织在此液内过夜也不至于过硬变脆，这一点较苯、二甲苯和甲苯优。但三氯甲烷比重较大，折光率较小，不能改变组织的折光率，组织在三氯甲烷中不易呈现二甲苯那样的透明现象，所以组织要比实际需要浸渍更长一些时间。
（3）香柏油香柏油是研究处理细柔组织的最佳透明剂，因它的硬化作用极小，组织在此液体内较长时间甚至几个月也可。过硬的组织（如皮肤和致密纤维组织）脱水后，用香柏油透明更容易切片。不过香柏油的浓度大，渗透力弱，同石蜡混合不及其他透明剂效果好，故常规石蜡切片一般不用。
透明时间的长短因组织的大小而异。例如脑组织和有血块的组织就应该缩短在二甲苯内留置时间，而一些肌肉组织和胃肠组织则应该稍延长在二甲苯内留置时间，最好先投入乙醇和透明剂等量混合液半小时，再入透明剂，待组织完全透明后进行浸蜡，一般需要半小时至2—3h。透明过久是否会导致组织过度硬化变脆，这取决于脱水的彻底与否，如果组织脱水完全彻底，则不会导致过度硬化和变脆，个别含胶样物质过多的组织例外。
（三）浸蜡
组织经透明之后，移入熔化的石蜡内浸渍，石蜡逐渐浸入组织间隙，取代透明剂，这一程序就叫浸蜡。根据所用石蜡的熔点，浸蜡需要能够保持于54～60℃温箱内进行。石蜡的质量和熔度与切片质量密切相关，因此对石蜡的选择应以注意。
用作浸蜡的石蜡质地均匀成半透明状，结晶及颗粒步，不含水分。石蜡中如有水分会结晶而变为白斑可用加热搅拌的方法除去。所有的蜡在使用前按常规必须用标准滤纸在漏斗内过滤到搪瓷杯里储存于浸蜡箱中。最好将石蜡于小锅中加热煮至近沸，冷却再煮反复数次后空气可以排除，挥发性油脂类在煮的过程中挥发。处置后的石蜡置于恒温箱中保持液体状态备用。所用的石蜡一般要求在52～56℃之间，这既可以支持硬组织也可使切片成条。使用时应根据组织类型以及制片时的温度和气候而异。夏季采用高熔点的石蜡，冬季则采用低熔点的石蜡。石蜡的熔点越低，其质地相应的较为疏松。硬蜡（熔点60℃）用于硬纤维组织。
（四）常规脱水剂脱水程序
表4—25常规脱水剂脱水程序
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程序时间分配
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小动物组织（大鼠、小鼠）大动物组织（犬、兔）骨（已脱钙）
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70％乙醇2—4h 4—6h 2—4h（2个）
80％乙醇2—4h 2—5h 2—4h（2个）
90％乙醇1—2h 2—4h 1—2h
95％乙醇1—2h 1—4h 1—2h
无水乙醇I 30min 1—2h 1—2h
无水乙醇II 30min 1—2h 1—2h
二甲苯I 30min 1h 2h
二四苯II 20min 30mir 2h
浸蜡（I）1—2h 1—2h 1—2h
浸蜡（II）1—2h 1—2h 1—2h
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五、包埋
包埋就是将已经过固定、脱水、透明、浸蜡的组织块从最后的蜡裕取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。
（一）石蜡包埋法
石蜡包埋法是制作光学显微镜切片的常规方法，操作简便，可进行连续切片，包埋后的组织可以长期保存。包埋的方法有自动包埋机包埋和手工包埋两种。手工包埋的步骤如下。
（1）组织浸入石蜡后，移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。
（2）准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。
（3）迅速镊取组织块故人包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。
（4）待石蜡表面凝固前将标箍贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。
（5）蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。
（二）石蜡包埋的注意事项
（1）作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求在60℃左右。
（2）包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏，使得组织变脆硬，并发生卷曲、收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度是否合适，温度不一致常可造成组织与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。
（3）包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。
（4）囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位，应将组织块直立拉平，不要卷曲。
（5）相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意方向的一致，以利切片。
