（4）检测原位PCR扩增产物的检测有两种方法：即通过探针检测的间接法（indirect PCR）和扩增同时测定核酸序列的直接法（direct PCR）。直接法检测虽较简便，但误检可能性相对较大，故现在多用间接法，使用标识探针杂交，通过DNB、NBT—BCIP使结果可视化。此外还可考虑结合使用高敏度染色法cARD。引物的选择仍是原位PCR能否成功的重要因素。要点有：选择特异性高的引物；长度20bp左右；Tm值稍高；引物自身不形成二聚体和发夹结构（hairpin）；正义链引物和反义链引物之间不形成二聚体；二个引物的Tm大致相同等。位于2条cDNA链端侧引物之间可有100～1000bp的距离，但从渗入组织的能力考虑，以400bp为宜。
3．具体操作方法
以CMV及HBV DNA原位PCR为例简介如下。
【操作步骤】
（1）石蜡组织切片7μm，常规脱蜡至水，0．1mol／L Tris—HCl洗。
（2）切片依次放人0．3％Tween、20、0．5％NP—40、0．1mol／L Tris—HCl（pH7．4）液内洗。
（3）20～50mg／L蛋白酶K（0．1mol／L Tris—HCl，pH8．0，0．01mol／L EDTA配制）37℃，15—30min。
（4）切片入1×PCR缓冲液内（10mmoi／L Tris—HCI，pH8．0，50mmol／LMgCL（2下标），0．01％明胶，0．05％Tween20，0．05％NP—40）60℃，5min。
（5）甩去多余的PCR缓冲液，每张切片加30μl预热PCR反应液（100pmol／L引物，250μmol／L dVTPs，其中5％dTTP用地高辛—11—dUTP代替，10mmol／L Tris—HCl，pH8．0，5mmol／L KCl，3mmol／L MgCl（2下标），0．01％明胶），60℃，1Omin。
（6）将切片从温箱中取出，每张切片加入5U Taq DNA聚合酶，用盖玻片覆盖，四周用Fixogum封闭，防止反应液的蒸发。
（7）将切片放入PCR扩增仪，第1次变性97℃，3min，以后94℃，1min，50％，1．5min，72℃，1．5min循环30次，最后一次延伸72℃，5min。
（8）切片用Buffer I（100mmol／L Tris—HCl，pH7．5，150mmol／l NaCL）洗，2Min。
（9）用含有2％正常羊血清和0．3％TritonX—100的BufferI封闭切片，30min。
（10）用碱性磷酸酶交联的羊抗地高辛Fab片段抗体，1：500（用含有1％正常羊血清和0．3％TritonX—100的BufferI配制），室温，1h。
（11）BufferI洗1Omin，2次。
（12）BuffeII（100mmol／L Tris—HCl，100mmokl／L NaCl，50mmol／L MgCl（2下标），pH9．5）洗10min。
（13）10ml Buffer中加入45μl硝基四氨唑蓝（NBT），35μ1 5—溴—4氯—3吲哚—磷酸（BCIP）、1mmol／L左旋咪唑。将切片放入其中，避光显色，5min—2h。
（14）用BufferIII（10mmol／L Tris—HCI，pH8．0，1mmol／L EDTA）中止反应。
（15）蒸馏水洗，0．02％快绿ECF复染，封片镜检。
三、重组PCR技术
重组PCR（recombinant polymerase chain reaction）是通过DNA重叠（overlap—ping）序列的衔接作用，使两个、三个甚至多个DNA分子重组在，起的体外扩增技术。其基本原理是通过多对引物，先分段对模板进行扩增，然后将分段PCR产物混合，再用一头一尾的一对引物对其进行扩增，通过各片段重叠序列间的碱基互补配对，从而获得全长PCR产物。
分段PCR产物的融合可以是一个基因多个片段的融合，或者是多个基因的融合。
重组PCR技术使基因全序列的拼接、基因内部的多点突变、基因的融合及标记、基因破坏及缺失等DNA操作变得简单易行。既节省时间又节省成本，如：一步法在基因内部引入多个突变位点；不经过质粒建建实现染色体基因敲除（knockout）和基因敲入（knock in）；表达包含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）等标记信号的融合蛋白，进行活细胞及转基因动植物中的蛋白质定位；启动子序列的交换及染色体倒置（inversion）等。随后发展的随机多重组PCR（randommulti—recombinant PCR，RM PCR）技术，更是充分利用了重组PCR的优势，通过蛋白质不同模块（block）、结构域（domain）或亚基（subunit）编码序列的改组（DNA shuffling），构建可变剪接文库（altrnative splicing library），或者模块酶（modular enzyme）或杂合酶（hybrid enzyme）的蛋白质库，实现酶的定向分子进化（directed molecular evolution）等。
（一）重组PCR技术要点
1．重叠引物设计
重叠引物又分为3′端的引导区和5′端的重叠区两部分。前一部分在初次PCR扩增靶基因过程中发挥重要作用，后一部分则在重叠延伸反应中起关键作用。重叠引物的长度应根据其解链温度（Tm）值来计算，即Tm=4（G十C）+2（A+T），以Tm值控制在50℃左右较为适宜。一般重叠区至少应有15—20bp长，总引物长度为40～50bp。如果待拼接的目的基因片段较长，引物的重叠区也应相应加长，否则，会使重叠延伸反应不完全。
2重叠延伸反应条件
初次PCR扩增产物按等摩尔数混合后，经过变性和复性，使加有互补末端的两个基因片段进行碱基互补和3′端重叠延伸反应。PCR反应条件中模板量、引物浓度、Mg2+（上标）浓度，dNTP含量、DNA聚合酶用量均十分重要，循环数及反应温度也很关键。
在100μl反应体系中，模板最较普通PCR反应时大，多为0．5—2μg。大模板量可有效地减少循环数，有利于降低DNA聚合酶引发的错配率；引物浓度较普通PCR浓度高，多为10μmol／L，适当加大引物浓度可提高扩增效率；Mg2+（上标）浓度是影响重叠延伸反应的最重要因素，高Mg2+（上标）浓度会增加扩增背景，增加Taq酶的错配率。故Mg2+（上标）浓度应比普通PCR反应浓度低，一般以0．5—2．5mmol／L理想；应适当提高dNTP浓度，推荐以50—200μmol／L为合适浓度。
重叠延伸时循环效应尽可能减少，有利于降低碱基错配概率，一般以30个循环为宜。前3～5个循环退火温度宜低，多设定为50℃，有利于重组片段的形成；后20～25个循环可将退火温度适当提高至60℃左右，以提高扩增产物的特异性。
3．DNA聚合酶的选择
Taq酶是PCR中最常用的耐热DNA聚合酶，具有5′—3′的聚合活性和外切活性，但缺乏3′→5′的外切校正活性。因此，Taq酶的错配牢在所有耐热DNA聚合酶中是最高的，约为0．1×10的4次方～2×10的4次方，累计错配率约为0．5％，随DNA拷贝数的倍增呈线性积累。减少Taq酶错配的策略包括纯化模板、提高模板浓度，减少循环数、降低Mg2+（上标）浓度等。有条件时，最好使用高保真DNA聚合酶如Vent polymerase，Pfu，Tli或AmpliTaq等具有纠错功能的酶，可有效地降低错配率，Vent酶的错配率较Taq酶低5—15倍。
4．引物和PCR产物的纯化
重组PCR对内、外引物的纯度要求较高，为减少非特异性扩增片段，最好使用经PAGE或HPLC方式纯化的引物。初次PCR扩增产物须经纯化方可用作重叠延伸反应的模板。纯化的目的在于去除初次PCR产物中非特异性扩增片段和多余的引物，特别是内引物。长度小于40nt的引物可用centricon 100离心纯化柱选择性过滤去除；如引物长度大于40nt，可采用低熔点凝腔电泳回收纯化。另外，还可采用醋酸铵／异丙醇沉淀法进行纯化。
（二）重组PCR的应用
重组PCR在分子进化、细菌染色体基因敲除及敲入、转基因植物转化载体的构建方面的实际应用。
【实验前准备】
（1）质粒和菌株质粒psP72、pKM14、pKM49、pGP5—WT、pKD46、Phagemid载体pBluescript IISK（+）以及野生型E．coli MGL 655和异柠檬酸脱氧酶基因（icdA）缺失菌株E．coli MG：icdA。质粒pBl 121、pVHB、pEGFP．NI及常规DNA转化宿主菌株E．coli DH5a。
（2）酶及生化试剂限制性内切酶和DNA标准分子量（1kb DNA ladder）；T4DNA连接酶、基因组DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒。
（3）引物设计本研究利用分子生物学分析软件Primer Premier5．0设计合成用于PCR扩增反应的引物序列。
【操作步骤】
（1）获得分段DNA的常规PCR反应PGR反应体系的总体积为50μl，其中含10～50ng模板DNA、0．2mmol／L各dNTP、0．1～0．5μmol／L，引物、2．5mmol／LMgCl2（下标）1．0U Herculase（DNA聚合酶）。
反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性1min，55℃复性45s，72℃延伸1kbDNA／min。30个循环后，72℃延伸10min。
（2）获得全长DNA融合产物的一步重组PCR在PCR反应体系中，将纯化的分段PCR产物混合，其中起重要衔接作用的DNA模板的古量是其他DNA模板量的2倍。加入相应引物，进行PCR反应，程序为：94℃预变性3min，94℃变性45s，55—65℃复性1min（梯度PCR找到最适宜退火温度），68℃延伸0．5kb DNA／min。35个循环后，72℃延伸10min。纯化后的PCR产物可直接用于细菌的基因敲除实验。
（3）获得全长DNA融合产物的二步重组PCR
第一步PCR反应体系中包含等量的分段DNA模板，但不含任何引物。反应参数：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸0．5kb DNA／min。7～1O个循环后进入第二步PCR反应。
第二步PCR反应体系是以第一步反应体系的产物为模板，同时加入两端引物，进行二次扩增反应，程序为：94℃预变性3min，94℃变性1min，55～65℃复性1min（梯度PCR拽到最适宜退火温度），72℃延伸1kb DNA／min。30个循环后，72℃延伸10min。
（4）E．coli染色体基因的敲除或入应用DNA同源重组原理，在受体细胞基因组中定点去除目标基因或（和）引入新基因，利用重组PCR将外源基因及靶基因上下游的序列融合在一起，不经过质粒构建，就实现了E．coli MG：icdA—染色体乳糖操纵子（lac opron）β一半乳糖苷酶基因（lacZ）的敲除及枯草杆菌IDH（Bacillussubtilis IDH，BsIDH）基因（cit C）的敲入。
细菌染色体基因敲除采用Datsenko法进行：将携带质粒pKD46的E．coil MG：AicdA接种于含树胶醛醣的SOB培养基，30℃培养至对数期后钙镁法制备感受态细胞。将重组的线性PCR产物转化感受态细胞，42℃热休克90s，加入1mlSOC培养基，37℃振荡培养1h，将转化液涂布于含相应抗生素的MD平板上，倒置培养20h。挑取数个转化子培养，提取基因组DNA，测序以鉴定染色体上基因的缺失及外源基因的插入。
（5）异柠檬酸脱氢酶粗酶液的制备及活性染色将培养的E．coli细胞在4℃以3000r／min离心15min，收集菌体悬浮于细胞破碎缓冲液中，其中含100mmol／LKH2（2是下标）PO4（4是下标）（pH7．0）、100mmol／L NaCL、2mmol／L MgCL2（2是下标）、1mmol／L EDTA、2mmol／LDTT。超声破碎细胞，裂解液在4℃经14000r／min离心20min，上清即为粗酶液。酶的活性染色按Dean等人的方法进行，在0℃将粗酶液与上样缓冲液混匀，经非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳后，将胶置于染色液中37℃避光染色2h。染色缓冲液含0．1mol／L Tris—HCL（pH7．6）、1mmol／L NADP+（+是上标）或3mmol／L NAD+（+是上标）、5mmol／L MgCL2（2是下标）、1mmol／L D，L—异柠檬酸、0．078mmol／L吩嗪硫酸甲酯（PMS）和0．25mmol／L氯化硝基四氮唑蓝（NBT）。
四、免疫PCR技术
免疫PCR（immuno—PCR）方法是Sano T，Smith CL和Cantor CR等于1992年将免疫学反应和PcR技术相结合而创建的一种新的检测技术，同时具有抗原一抗体反应的特异性和PcR扩增技术的高效性。它运用PCR强大的扩增能力来放大抗原一抗体特异性反应的信号，使实验中只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到1至数个抗原分子。这种灵敏度使免疫检测技术达到了一个新的高度，使低于常规检测方法极限的痕量抗原的检测成为可能。
免疫PCR把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的指数扩增能力有机结合起来，它基于ELISA，以PCR扩增一段DNA报告分子的方式代替ELISA的酶促显色反应，大大提高了对抗原一抗体结台信号放大的能力，从而提高免疫检测的能力。它用DNA分子标记抗体，作为探针与待测抗原反应，形成抗原—抗体—DNA复合物；通过PCR扩增复合物上的这段DNA分子，根据特异性PCR产物的有无，来判断待测抗原是否存在。目前，国内外报道免疫PCR的敏感性一般比现行的ELISA法高10的平方～10的8次方倍。免疫PCR可以同时进行多种抗原／半抗原检测；有更宽的线性范围。
