【原理】活细胞具有排斥某些染料（如伊红、台盼蓝、苯胺黑等）的能力，死细胞由于膜完整性被破坏，细胞即被着色。
【实验方法】
（1）指数生长期的肿瘤细胞4×10的4次方个接入25ml塑料或玻璃组织培养瓶中，加入含5％新生牛血清（或胎牛血清）的RPMI－1640培养基－4ml，置于37°Ｃ、5％CO2的孵箱中培养12～14h。
（2）加药前细胞换取新鲜培养基3．6ml。每瓶加受试药物400ul，置于37℃、5％CO2的孵箱中培养一定时间。
（3）悬浮生长的细胞混匀后离心收取细胞悬液0．2ml（贴壁生长的细胞先用胰蛋白酶、EDTA液消化），加0．4％台盼蓝液（台盼蓝0．4g溶于100ml含0．81％氯化钠和0．06％磷酸钾的水中）0．5ml，Hank‘s平衡盐液（HBSS）0．3ml，充分混合后室温放置5～15min。
（4）用毛细滴管将台盼蓝一细胞悬液滴在血细胞计数板上。
（5）染色按计数白细胞的方法分别计数未染色的活细胞及染成蓝色的死细胞。
【结果分析】
（1）活细胞率（％）＝（未着色细胞／细胞总数）×100％，对照组的活细胞率应在90％以上。
（2）以活细胞率与药物浓度的对数作图，得S形剂量反应曲线，按统计学方法算出半数致死浓度（LD50）。
（3）当LD50≤10ug／ml并能重复时，提示应进一步实验。
4．SRB法谢定药物对癌细胞杀伤作用的选择性
【原理】Sulforhodamine B（SRB）是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在515nm的OD读数与细胞数成良好的线性关系，故可用作细胞数的定量。
【材料与方法】
（1）所用的细胞系及方法（1）～（6）同MTT法。
（2）SRB用1％醋酸配成0．4％溶液。细胞在加药培养结束后用三氧醋酸（TCA）固定。贴壁细胞每个小孔加预冷的80％TCA液50ul（TCA最终浓度为10％）固定，加TCA时必须轻轻地加在培养液表面，静置5min后再将平板移至4℃放置1h，这样可使悬浮细胞固定在培养孔的底部。
（3）倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。
（4）每孔加入SRB液，在室温放置10min。未与蛋白结合的SRB用1％醋酸液洗5遍，空气干燥。
（5）结合的SRB用150ul 10mmol／L非缓冲Tris碱液（pH10．5）溶解。
（6）用自动化分光光度平板读数计在515nm波长处测定每个小孔的OD值。
【结果分析】
（1）除了测定对照组细胞（C）及加药组细胞（T）的OD值外，用另外的对照平板测定加药时的细胞OD值（T0）。在加药前即可将平板中接种的细胞用TCA固定。
（2）如果加药组最终的OD值大于T0，说明细胞在加药后仍然生长。
生长率％＝［（T－T0）／（C－T0）］×100％
此式以对照组生长率为100％，计算加药组生长率相当于对照组的百分率。
（3）如果加药组最终的OD值小于T0，说明加药后细胞被杀死。
细胞的杀死率％＝［（T－T0）／T0］×100％
（4）50％生长抑制所需的药物浓度（GI50）公式［（T－T0）／（C－T0）］＝50。在此药物浓度下，细胞数的增长降低为对照组的50％。
（5）完全生长抑制（total growth inhibition，TGI）在此药物浓度下，细胞便不再增长，即T＝T0时的药物浓度。
（6）杀死50％细胞所需的药物浓度（LG50）［（T－T0）／（C－T0）＝50时的药物浓度。
Monks等用20种已知抗癌药物对6种细胞系进行了SRB分析，发现药物作用4天时有92．0％药次达到GI50，88．4％药次达到Gl50，75．9％药次达到TGI，59．8％药次达到LC50。
（7）抗肿癌药物体内活性研究
人体疾病和动物模型之间的共同病因学是成功开发新药的重要基础。尽管各类人体肿瘤甚至同类肿瘤的病因并不完全一致，其与动物肿瘤模型之问的相关性尚不明确，但利用建立体内肿瘤移植模型来探讨肿瘤生长的本质及规律，或寻找对肿瘤生长有抑制作用的药物与治疗方法的技术仍不失为肿瘤学中最基本的研究手段和途径。
1．动物肿瘤移植模型实验
在抗肿瘤药物药教学初步筛选或初步有效性的评价中，体内实验采用小鼠肿瘤移植模型。动物肿瘤移植模型常采用昆明种小鼠或纯种小鼠肿瘤，观察受试物对肿瘤生长的抑制作用。小鼠肿瘤移植瘤模型具有实验周期短，重复性好，所需空间小，费用相对较低，可以定量分析并可根据不同肿瘤采取不同治疗方案或条件等优点。对于缩小药物筛选范围、判定化合物的开发前景具有十分重要的意义。
但由于小鼠肿瘤移植模型采用的是动物的肿瘤组织，不是人源的肿瘤组织，无法直接模拟药物的临床疗效，与临床抗肿瘤药物治疗的实际情况有较大差别，因此动物肿瘤移植模型仅可用于候选化合物的初步筛选或初步有效性的判断。
鉴于小鼠移植肿瘤模型的重要性和复杂性，1999年美国MMHCC（the MouseModels of Human Cancer Consortium）着手建立小鼠移植瘤的评价标准，以试图解决各个模型可以反映人类肿瘤对应的方面的问题。这些研究工作将进一步促进小鼠移植瘤模型的合理和有效应用，在抗癌药物研发中发挥更大的作用。
（1）常用动物瘤株及动物的选择目前在新药筛选及初步有效性评价中，常用的动物瘤株及对应应用的小鼠如下。
①肉瘤180（S180），艾氏癌腹水型（EAC），实体型（EC），肝癌实体型（Heps），Harding－Passey黑色素瘤，未分化型胶质瘤G422等，可用昆明种小鼠。
②小鼠网织细胞白血病（L615）应用纯种615小鼠。
③小鼠淋巴细胞白血病L12l0和P388，应用纯种DBZ／2或CDF小鼠或BDF小鼠。
③Lewis肺癌、黑色素瘤B16、小鼠乳腺癌（M5076），应用C57BL／6纯种小鼠或BDF或CDF小鼠。
⑤动物必须健康，符合等级动物要求，实体型肿瘤雌雄动物均可，但同一批实验中治疗组与对照组性别必须相同，腹水型肿瘤一般使用雌性动物。小鼠体重18～22g，每组动物至少10只。
（2）实验方法及疗效评价
①皮下接种模型
【实验方法】选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠，颈椎脱位处死，在无菌条件下（超净台或接种罩），用碘酒、乙醇或苯扎溴铵消毒动物皮肤，切开皮肤，剥离肿瘤。将瘤组织剪切成1．5mm左右的小块，用套管针接种与动物一侧或双侧腋窝皮下；或制成细胞悬液，然后按一定比例加入无菌生理氯化钠注射液，每只小鼠接种肿瘤细胞数量一般为1×10的6次方－5×10的6次方个。接种次日将动物随即分组，受试药设高、中、低3个剂量组，给药一次或多次。给药途径与拟临床给药途径一致。阴性对照组给予相应的溶剂，阳性对照采用相当剂量的已知药（最好是与受试药类型相似）。实验期间对照组动物死亡数不应超过20％，给药途径应与推荐临床用药的途径相同，静脉给药者可用腹腔注射代替。
【疗效评价】实验结束后处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。阴性对照组肿瘤平均瘤重小于1g，或20％肿瘤重量小于400mg，表示肿瘤生长不良，实验作废。阳性药对照组瘤重与阴性对照组瘤重进行比较，经统计学处理应有显著性差异（P＜0．05）。
疗效评价指标为肿瘤生长抑制率，按下式计算：
肿瘤抑制率＝（C－T）／C×100％
式中T为各给药组平均瘤重；C为明性对照组平均瘤重。
当经统计学处理抑瘤率＞30％，经统计学处理有显著性差异（P＜0．05）且经2次重复实验证明后，则评定该药对肿瘤有一定疗效。
②腹水瘤及白血病
【实验方法】无菌条件下，取接种后6～8天的动物肿瘤腹水以生理氯化钠注射液稀释，无菌条件下给每只鼠腹腔接种0．2ml，分组及给药方法与实体瘤相同。但应注意，此时静脉给药不可使用腹腔给药代替。
【疗效评价】接种后，观察和记录动物死亡时间，计算生存天数，如阴性对照组内20％动物存活超过4周，说明腹水癌生长不良，实验作废。在接种后30或60天，用以下公式计算生命延长率：
生命延长率＝（T－C）／C×100％
式中C为对照组平均生存天数，T为给药组平均生存天数。阳性药对照组生存天数与阴性对照组进行比较，经统计学处理应有显著性差异（P＜0．05）。
如治疗动物生存超过60天，记录长期存活率或动物数。
非腹腔内给药时生命延长率＞30％，腹腔内给药时生命延长率＞50％，经统计学处理有显著性差异，2次重复实验证明后，则评定该药对肿瘤有一定疗效。
2．人癌异体移植模型实验
在抗肿瘤药物药教学的有效性及可靠性评价中，体内实验一般采用人癌异体移植模型。在新药抗肿瘤药效学研究中，所使用的移植瘤组织种类和数量要足够多，一般药物临床前体内实验至少应选用3～4种人癌异体移植瘤模型，实验至少应重复一次。在体内有效性实验采用的全部人癌异体移植瘤模型中，一般至少应有3种达到有效标准，才提示受试物有必要进入临床实验。通常在无胸腺鼠（裸小鼠）或联合免疫缺陷小鼠体内移植人癌细胞系，观察受试物对肿瘤生长的抑制作用。主要包括人癌裸小鼠皮下移植模型、人癌裸小鼠肾包膜移植模型及原位移植瘤模型等。人癌裸小鼠皮下移植模型是抗癌药物体内活性评价和其他实验性肿瘤研究的最常用模型，它具有操作简单，易于观察和判定结果，能维持来源肿瘤的组织结果和生化特征等优点，在肿瘤生物学和质量学上起重要作用。其缺点是缺乏人癌最典型的转移性。人癌裸小鼠肾包膜移植模型的原理主要基于肾包膜下血液供应丰富，肾包膜与肾实质之间组织疏松，易于分离的原理。其优点是肿瘤接种较方便、肿瘤生长良好、实验周期短，但其缺陷在于实验数据个体差异较大，且移植瘤的生长受限。鉴于肾包膜下率较高的特点，该模型现常被用于临床肿瘤患者手术标本的药物敏感实验。
原位移植模型是指将来源于人体某脏器的肿瘤接种在动物的同一脏器中，如将人肝癌接种在裸小鼠的肝脏。其优点是移植瘤成活率高、保持了原有肿瘤的组织结果和生物学特性、在宿主体内具有类似原肿瘤的恶性生物学行为生长，它在开发抗等方面有广阔的应用前景。
由于人癌异体移植模型与临床疗效之间的相关性较强，通常情况下，以人癌异体移植模型实验结果来评价抗肿瘤药物的有效性及可靠性。
