一、抗肿瘤药概述
（一）肿瘤的分类
1．良性肿瘸
机体内某些组织的细胞发生异常增殖，生长比较缓慢，与正常组织细胞相似，无核分裂或核分裂稀少，无病理核分裂现象。
2．肉瘤
来源于间叶组织（包括结缔组织和肌肉）的恶性肿瘤，多发生于皮肤、皮下、骨膜及长骨两端。常见的有平滑肌瘤、淋巴肉瘤、滑膜肉瘤、纤维肉瘤等。
3．癌
来源于上皮组织的恶性肿瘤。如鳞癌常发生在身体原有鳞状上皮细胞覆盖的部位，包括皮肤、口腔、唇、子宫颈、阴道、食管、喉、阴茎等处。发生于腺上皮细胞的腺癌多见于胃、肠、肝、乳腺、甲状腺、唾液腺、支气管及子宫体等处。
癌症本质上表现为细胞失去控制的异常增殖，这种异常生长的能力除了表现为肿瘤本身的持续生长之外，还表现为对邻近正常组织的侵犯及经血管，淋巴管和体腔转移到身体其他部位，而这往往是癌症致死的原因。目前癌症已成为人类死亡的主要原因之一，每年全世界约有700万人死于癌症。
（二）发病机制
1．肿瘤细胞生物学特性
肿瘤是人体中正在发育的或成熟的正常细胞在某些因素长期作用下，出现过度增生或异常分化而形成的。肿瘤细胞与正常细胞相比，有形态结构、功能、代谢和遗传性状等方面的异常，它们具有超常的增生能力。与正常组织细胞相比，癌细胞代谢特点表现为组成细胞基本结构的物质如蛋白质、核酸等的合成异常旺盛，其分解代谢则显著降低，以事合成和分解代谢失衡，无氧酵解功能增强。
癌细胞脱离了机体的控制，表现为不间断的生长繁殖和分化不良，癌细胞容易脱离、溶解并通过淋巴道转移、血道转移、种植性转移三种途径扩散到其他组织器官。正是由于癌细胞具有向周围组织乃至全身转移和扩散的特征，手术治疗才难以从根本上治愈癌症。
2．癌基因激活与抑癌基因失活
研究表明，肿瘤的发生是在各种外部因素参与下、多种基因共同作用的结果，包括癌基因的激活和抑癌基因失活及细胞周期的异常。癌基因是指细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的一类基因，如Ras、Myc、Src、Bd－2等基因。这类基因在人的正常细胞中存在，但不表示或其表达水平不足以引起细胞的恶性转化。在正常情况下，癌基因对人体非但无害，而且对细胞的生长和分化均起着重要的作用。只有当正常细胞受到外界致癌因素的反复作用后，细胞内处于静止状态的癌基因就被激活，基因结构产生突变或基因表达失去控制，使细胞原有的正常生物学性状发生改变，从而破坏正常细胞代谢的动态平衡，就会启动细胞生长，发生恶性转化，产生癌细胞。
3．细胞增殖与细胞凋亡失衡
肿瘤是由细胞增殖和死亡失衡所致。细胞从一次分裂结束到下次细胞分裂完成，这段时间称为细胞增殖周期。肿瘤组织细胞按其分裂可分为三类。
（1）增殖期细胞这类细胞能不断按指数分裂，代谢活跃，增殖迅速，是肿瘤组织不断增大的根源。此类细胞对多数抗恶性肿瘤药敏感性高。按其分裂过程分为四个期：①G（下标1）期（DNA合成前期）：此期蛋白质、酶等合成旺盛，为DNA的复制做准备。此期约占增殖周期的一半时间。②S期（DNA合成期）：此期进行DNA复制，为细胞分裂做准备。③G（下标2）期（DNA合成后期）：此期继续合成与有丝分裂有关的RNA、蛋白质和其他物质。④M期（有丝分裂期）：经有丝分裂后一个细胞分裂成两个子细胞。
（2）静止期细胞［G（下标0）期］此期为暂时不增殖的细胞，当增殖期细胞被杀灭后，G（下标0）期细胞可进入增殖周期，以补充其损失。此期细胞为肿瘤复发的根源，对药物敏感性低，应设法消灭之。
（3）无增殖力细胞在肿瘤组织中这部分细胞很少，不能进行分裂，通过老化而死亡，无治疗上的意义。
细胞无限制地生长和分裂是肿瘤发生的基础，同时还与细胞凋亡机制密切关联，癌基因与抑癌基因也和细胞凋亡的调控有直接的联系。细胞凋亡的启动和传导需要多种基因及其产物的参与，一旦平衡被打破就会出现细胞凋亡异常。
4．脂氧合酶在肿瘤发生中的机制
多种脂氧合酶的同工酶在介导不饱和脂肪酸代谢与肿瘤发生之间具有重要作用。其中12－LOX、8－LOX或5－LOX能够促进肿瘤的发生与发展，其作用机制可能是：促进瘤细胞增殖，抑制凋亡与分化；促进新生血管形成。而另一组LOXs的同工酶主要包括15－LOX（下标1）和15－LOX（下标2），可抑制肿瘤形成。抗癌作用与促癌作用之间存在动态平衡。
（三）常用的抗恶性肿瘤药
1．烷化剂
是一类化学活性很强的化合物。含有活泼烷基如乙亚胺基、磺酸酯基等，可与细胞的巯基、氨基、羧基、磷酸基等起烷化反应。使细胞的DNA、RNA、酶、蛋白质变性，阻止细胞分裂甚至使其死亡，属周期非特异性药物。它对生长发育愈快的组织作用愈强，故对恶性肿瘤组织有相对选择性，但对人体生长较快的正常组织也亦损害，因此毒性较大。
2．影响核酸生物合成的药物
又称抗代谢药物，本类药物与机体正常代谢物质如叶酸、嘌呤碱、嘧啶碱等化学结构相似。因此能与有关代谢物质发生特异性拮抗作用，从而干扰DNA的合成，阻止肿瘤细胞的分裂增殖，属细胞周期特异性药物，主要作用于s期。也包括能与DNA碱基产生链内及链间交卫连结、阻止DNA转录及复制的铂类药物。
3．激素类抗肿瘤药物
应用一些激素或抗激素，体内激素平衡受到影响，使肿瘤生长所依赖的条件发生变化，肿瘤的生长可因此受到抑制。激素治疗有效的先决条件是肿瘤细胞上具有激素受体，并且肿瘤细胞的生长和繁殖在一定程度上仍受激素控制，通过改变机体激素水平，有效控制肿瘤生长。
4．抗肿瘤抗生素
为细胞周期非特异性药物。此类药物与肿瘤细胞的DNA交叉联结或破坏DNA基本结构，干扰DNA的复制或转录过程，从而抑制mRNA和蛋白质的合成。
5．抗肿瘤植物药
如长春碱类，包括长春碱和长春新碱均为夹竹桃科植物长春花提取的生物碱。能与细胞核中的纺锤丝微管蛋白结合并使其变性，使纺锤丝形成发生障碍，有丝分裂停止在中期，阻碍细胞增殖，属于作用于M期的周期特异性药物。
二、抗肿瘤药主要药效学研究
人类为了认识和诊治肿瘤，曾探索各种不同的方法和途径，在经历了170多年后，终于建立了较为系统和完整的肿瘤效学实验研究体系和方法（包括整体、细胞和分子水平）。肿瘤实验研究的发展大致可分为四个主要阶段：第一阶段（1834年～1915年）为萌芽阶段，人们着手考虑如何使用实验研究手段去探索肿瘤的奥秘，进行了初步的肿瘤移植研究；第二阶段（1915年～1966年）为发展阶段，从动物诱发肿瘤模型开始建立到大量可移植性动物肿瘤模型建立及应用；第三阶段（1966年～1980年）为迅速发展阶段，裸小鼠的培育成功，开始直接利用人类肿瘤进行各种实验并广泛开展了体外培养研究；第四阶段（1980年至今）进入分子生物学研究阶段。
抗肿瘤药物临床前药效学研究主要分为体外药效学实验和体内药效学实验。体外实验主要是用于筛选候选化合物，初步了解受试物的作用机制、敏感肿瘤类型和作用强度，为随后进行的体内实验提供参考。体内实验是用于进一步考察受试物对特定类型肿瘤细胞的杀伤或抑制作用，探索受试物产生药效作用的给药剂量、途径、频率和周期等。
（一）抗肿瘤药物体外药效学研究
虽然抗肿瘤药物的体外筛选方法具有假阳性和假阴性率高、对药物的敏感性可能与体内实验不同、难以评价药物作用的选择性等缺陷，但因其操作简便、节省动物、饲养设备少、用药量少、可直接从人体肿瘤取材、得出结果快速等优点，因而被广泛应用于抗肿瘤药物的筛选研究。
抗肿瘤药物的体外实验方法主要是在体外培养的不同人肿瘤细胞系中加入不同浓度的受试物，采用集落形成法、四氮唑盐还原法（MTT法）、台盼蓝染色法、磺酰罗丹明染色法（SRB法）等方法进行检测，计算受试物的半数抑制浓度［IC（下标50）］，并与阳性对照药进行比较，以初步预测受试物的作用强度和对不同类型肿瘤细胞的敏感性。一般应至少选用12种人癌细胞系进行实验。实验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影响。
实验应设阳性和阴性对照组，阳性对照为化学结构类似，具有相同或类似作用机制的抗肿瘤药物，阴性对照为溶媒对照。实验至少应重复一次。
1．用集落（克隆）形成法测定药物对肿瘤克隆原细胞的抑制作用
应用细胞培养基，使人癌细胞体外生长、增殖、形成细胞集落或集簇，结合药物的作用，观察其对细胞集落生长的抑制情况来判断药物的是否敏感。
【原理】克隆原细胞（clonogenic）也称干细胞（stem cell），指具有持续分裂能力的细胞。肿瘤的生长、转移、复发均以克隆原细胞的增殖为基础。当单个细胞连续分裂6代或以上时，其后代所组成的群体（集落）便含50个以上的细胞。当培养物接种的细胞较稀疏时，每个集落彼此不接触，通过集落计数可对克隆原细胞做定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药活性，被认为是一种较灵敏的测验法。常用的集落形成法可分为贴壁法及半固体培养基法。
【材料与方法】
（1）贴壁集落适用于各种贴壁生长的细胞。
①取指数生长期贴壁细胞一瓶，经消化后做成单个分散细胞悬液，台盼蓝染色做活细胞计数，用生长培养基稀释成每毫升500个细胞。
②取35ml培养皿（或15ml培养瓶），每3个一组，各加受试药物20μl，稀释后的细胞悬液2ml，摇匀后在含5％C0（下标2）的37℃温箱中静置7天。
③弃去培养液，用瑞士姬姆萨染色后在20倍解剖显微镜下计数含50个细胞以上的集落。
（2）软琼脂集落适用于悬浮生长的各种细胞。
①取对数生长期细胞1瓶，做活细胞计数，用含15％新生牛血清的培养液配成1000个细胞／ml的悬液，置37℃水浴预温。
②取35mm培养皿，3个一组，每个加受试药物20μl。
③底层琼脂的制备：取37℃保温的新鲜培养液9份，加入在沸水浴中融化的5％琼脂液1份，摇匀后迅速加入平皿，每个1ml，摇匀药物后置室温使琼脂凝固。底层琼脂的最终浓度为0．5％，内含受试药物。
④上层琼脂的制备：取37℃预温的细胞悬液按每9．4ml加煮沸融化的5％琼脂液0．6ml的比例摇匀，加入已铺底层琼脂的平皿中，每个1ml，置室温使琼脂凝固。上层琼脂含肿瘤细胞，琼脂浓度为0．3％。
⑤将平皿置密闭在培养盒中，通入含5％CO2，5％O2及90％N2的混合气体。在37℃培养7天。
⑥在16倍解剖显微镜下计数直径大于75um（50个细胞以上）的集落。
【结果分析】
（1）集落抑制率（％）
集落抑制率（％）＝（1－给药组集落数／对照组集落数）×100％
抑制率≥50％为细胞对药物敏感，＜50％则为耐药。
药物敏感指数（sensitive index．SI），即SI＝对照组－集落形成单位（GM2CFU）存活百分数／白血病－集落形成单位（L2CFU）存活百分数；若SI＞1，则细胞对药物敏感；SI＝1，则药物对白血病细胞杀伤无选择性；SI＜1则为细胞对药物耐药。
（2）克隆原细胞存活曲线以集落的存活分数的对数与药物浓度作图。由于药物对细胞的致死作用一般遵循一级动力学，即一定量的药物杀死一定比例的细胞，为一个带肩的指数曲线。其方程式为S＝1－（1－e（－D/D0）次方）n次方；S为存活分数，D为剂量，D0为存活分数每下降1／ｅ所续的剂量（e为自然对数之底，1／e＝0．37，故D0为使细胞存活率下降至37％所需的剂量），n是曲线的指数部分外推至Y轴的截距。D0代表细胞对药物的敏感性，D0越小，敏感性越高。Ⅳ反映细胞对药物引起损伤的修复能力，n越大，表示杀死细胞所需的剂量越大。
2．四氮唑蓝法（MTT assay）
【原理】本实验方法是Mosmman于1983年率先建立的。其原理是活细胞线粒体的琥珀酸能使外源性的MTT即3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，在490nm检测其光吸收值，可间接反应活细胞数量。MTT法是目前检测细胞增殖与活性的常用方法，临床多用于肿瘤细胞的药敏实验，观察细胞因子对细胞增殖的影响等。
【实验方法】
（1）取处于指数生长期的细胞培养1瓶，加入适量胰酶消化，使贴壁细胞脱落，用10ml含5％胎牛血清的RPMI－1640培养液配成悬液。
（2）用台盼蓝染色后在血细胞计数板上做细胞计数。
（3）用完全培养基稀释细胞悬液．配成每1ml含10000～40000个细胞。
药理学实验方法
（4）取96孔平板，每孔加细胞悬液100ul。将平板置37℃的5％CO2温箱24h。
（5）受试化合物作5个稀释度，最大浓度为10（－4）次方mol／L，依次做1：10稀释（10（－4）次方，10（－5）次方，10（－7）次方，10（－8）mol／L）。天然产物的粗提物最大浓度用250ug／ml，也做1：10稀释，使用完全培养基稀释。每一浓度至少做3个复孔，每空加入100ul药液。井同时加入阳性对照药和阴性对照液。
（6）将平板在37℃，含5％CO2空气及100％湿度的温箱中孵育2～3天。
（7）MTT用无血清RPMI1640培养液配成1mg／ml溶液，每孔加50ul，37°Ｃ温育4h，使MTT还原为甲臜。
（8）吸出上清液，加入100ul DMSO使甲臜溶解，用平板摇床（plate shaker）摇匀10min。
（9）用酶标仪在550nm处测定每个小孔的光密度。
【结果分析】
（1）细胞的存活率将各测试孔的OD值减去本底OD值（完全培养基加M1T，无细胞）或空白药物孔OD值（完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞），各重复孔的OD值取均数X±SD。
细胞的存活率以T／C（％）表示，T为加药细胞的OD值，C为对照细胞的OD值。
T／C（％）＝（加药细胞OD／对照细胞OD）×100％
（2）采用Logic法求出T／C＝50％时的药物浓度（IC50）
（3）根据受试物的半数抑制浓度（IC50），与阳性对照药进行比较，以初步预测受试物的作用强度和对不同类型肿瘤细胞的敏感性。
3．染料拒染法（dye exclusion assay．DEA）
