一、目的与要求
1.明确继代培养在植物组织培养中的地位和作用，熟悉和巩固培养基配制与灭菌方法，学习基本培养基和激素种类的选择和配比以及无菌操作技术。
2.通过学习，使学生掌握试管苗继代培养的相关技术，能够独立地进行试管苗继代培养，并对实验结果进行考核。
二、原理
继代培养又称增殖培养，是将培养的试管苗增殖的茎芽切取下来，转入新的培养基上培养增殖。当试管苗在三角瓶内生长至瓶口或培养基消耗快完时就要及时转接进行继代培养，从而得到大量试管苗，以便达到一定数量时进行生根和移栽。
试管苗试管内再生增殖一般通过以下几种途径。
1.原球茎发生型。
2.胚状体发生型：可以利用植物茎尖、子房、花药、未成熟胚等器官或组织离体培养诱导体细胞胚发生。
3.器官型：由离体的植物茎尖、叶片、根、花丝、花瓣、花梗、鳞片等器官上直接诱导分化出小植株。
4.器官发生型：利用植物叶片、叶柄、茎段、根和花器官等离体培养诱导出愈伤组织，再诱导愈伤组织分化出不定芽和根，形成再生植株。
5.无菌短枝型：将待繁殖的枝条剪成带顶芽或去除顶芽的腋芽茎段，经表面灭菌处理后，在无菌条件下接种。
能否保持试管苗在继代培养中的较高增殖系数，是微繁成功的关键。众多研究表明，影响试管苗增殖的主要因素除了材料基因型外，还有基本培养基和细胞分裂素等。因此在试管苗继代培养制备培养基时，选择适宜的基本培养基以及细胞分裂素的种类和浓度，达到继代增殖的目的。试管苗继代培养除了继代培养基选择和制备以外，另一个关键点就是无菌操作技术。试管苗本身是无菌的，如果操作不当，出现污染，会造成继代培养失败。本实验通过试管苗继代培养，老师示范操作，学生独立操作，让学生掌握无菌操作技术。
三、材料、仪器、试剂
1.材料
无菌试管苗，如枸杞、大花惠兰、树莓等试管苗。
2.仪器和用具
超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、电炉或微波炉、光照培养箱或人工智能气候箱、电子秤、手术刀、尖嘴镊子、搪瓷缸、培养皿、三角瓶、烧杯、量筒、移液管、玻璃棒、记号笔、pH试纸、封口膜、线绳、石棉网等。
3.试剂
基本培养基各种母液、激素母液、蔗糖、琼脂、1mol/L盐酸、1mol/L氢氧化钠、70%乙醇。
四、实验步骤
1.基本培养基选择
根据试管苗材料确定基本培养基的种类，可以由老师选择，也可以由学生提前查阅文献选择。
2.激素种类和浓度的选择和配比
在确定植物材料和接种外植体类型条件下，既要考虑试管苗在继代培养时的增殖系数，又要考虑试管苗的生长势。可以由老师选择，也可以由学生提前查阅文献选择。
3.继代培养基的配制和灭菌
参考培养基配制和灭菌实验。
4.无菌操作程序
（1）准备工作：接种操作前应进行无菌操作室地面的清洁卫生，并用70%的乙醇喷雾使空气中的灰尘沉降。操作人员要穿上工作服，洗净双手。
（2）开启超净工作台：将灭菌后的继代培养基、接种工具等放在超净工作台的台面上，酒精灯添加酒精，打开紫外灯和风机。20min后关掉紫外灯，再等30min后将无菌试管苗带入无菌操作室。
（3）接种操作：先用70%乙醇浸泡的脱脂棉球擦洗双手和工作台面。
①点燃酒精灯，打开培养皿。
②接种工具烧灼灭菌。
③左手拿装有试管苗的三角瓶或试管，用右手解开线绳，再用右手轻轻取下封口膜，以免封口膜上的灰尘飞扬，造成污染。将瓶口倾斜，靠近酒精灯火焰，在灯焰上旋转烧灼，然后用镊子将材料取出放在培养皿中的无菌滤纸上。
④左手拿镊子，右手拿手术刀进行材料切割。去掉材料的老化或褐化部分。切割时要根据试管苗材料的不同进行切割，如苹果切割成带有腋芽的茎段，百合切下新增殖的子球。
⑤打开装有继代培养基的三角瓶，方法同上。用镊子将切割的外植体送入三角瓶中，茎段等要将基部插入固体培养基中，外植体在三角瓶内的分布要均匀，以保证必要的营养面积和光照条件。一般每瓶接种3个～5个外植体。
⑥将瓶口在酒精灯火焰上旋转烧灼数秒钟，盖上封口膜，扎好线绳，标注材料名称、接种日期、学生班级和姓名。
5.分组示范
无菌操作室容纳人数有限，将学生分成小组，按照无菌操作程序，老师进行分组示范操作。在操作过程中，强调无菌操作过程中注意要点。
6.学生操作
在学生操作过程中，老师进行指导和纠正。每个学生接种5瓶～10瓶。
五、要求
将接种的三角瓶放到培养箱或培养室中培养，观察、调查和分析实验结果。1周后调查污染情况，根据污染瓶数进行打分，分析总结污染原因。4周后调查试管苗继代培养中增殖和生长情况，分析基本培养基和激素种类以及配比是否适宜。
【作业】
1.枸杞、大花惠兰、树莓三种植物在试管内的增殖方式有何差异，继代培养用剪刀剪取时应注意哪些事项（或者如何剪）？
2.三种试管苗继代增殖时对基本培养基与细胞分裂素的要求如何？
3.请认真填写本项目的实训报告单。
