一、目的与要求
1.掌握无菌材料培养操作的基本技术。
2.熟悉植物组织培养无菌材料建立的全过程。
二、原理
进行植物组织培养时，首先面临的是材料的选取问题，而植物材料几乎是生长在田间或温室中，不可避免地受到真菌、细菌以及微生物对植物的影响和危害，如果将这些未消毒的材料接种到培养基上进行培养，等于进行了真菌、细菌、微生物等的培养。因此，进行植物组织培养时，首先是对植物进行一系列的清洗以及消毒处理，然后在超净工作台上进行严格的无菌操作并接种，最终将这些植物试材培养成无菌材料，然后通过它们的生长，增殖继代培养，建立无菌培养系。
选外植体应取细胞全能性容易表达的，具有一定分裂、分生能力，染菌较少的材料（部位）来建立外植体，这种外植体容易启动，容易进行植株再生，而且可以短时间长效保持母本性质。
三、材料、仪器、试剂
1.植物材料的选取（以树莓为例）
（1）茎尖、叶芽：应在开春接近萌动时取用，也可把休眠芽带枝一起剪回，插入清水或培养液中使之萌动，待芽苞膨大后可剥去外层鳞片然后于超净工作台上进行消毒，1个短枝上可留1个芽或2个芽接种到培养基上。
（2）种子无菌苗：树莓籽→剥壳→消毒→培养基（不加激素）→形成苗→切下带子叶茎尖或有用下胚轴→进行不同培养基培养。
（3）叶片：如用温室或田间材料应取新梢顶部2片~3片叶，采回后用洗洁净洗涤→清水冲洗→超净工作台上消毒→每片叶剪取中部或下部进行培养，或将叶剪成0.5cm2方块进行培养。
2.仪器和用具
（1）超净工作台
（2）高压灭菌锅
（3）微波炉
（4）配制培养基的所有器具
（5）无菌操作所用的各种器具
3.试剂
（1）常用植物材料的消毒剂：氯化汞、次化酸钠、过氧化氢、硝酸银、次氯酸钙
（2）MS培养基
四、步骤
1.植物材料的表面消毒
为了避免有害细菌和真菌对培养和再生植株的危害，在用作离体培养前可对植株进行表面消毒。
2.植物材料的消毒与灭菌
（1）茎尖、茎段及叶片等的消毒：植物的茎、叶大部分暴露于空气中，有的本身具有较多的茸毛、油脂、蜡质和刺等，在栽培上又受到泥土、肥料中的杂菌污染，所以消毒前要经自来水较长时间的冲洗，必要时用软毛刷刷洗，硬质材料可用刀刮，然后在自来水龙头下流水冲洗，时间长短视材料的清洁程度而定。冲洗后可用肥皂、洗衣粉或吐温等进行洗涤。消毒时要用70%的酒精浸泡数秒钟，以无菌水冲洗2次～3次，然后按材料的老、嫩和枝条的坚实程度，分别采用2%～10%的次氯酸钠溶液浸泡10min～15min，若材料有茸毛最好在消毒液中加入几滴吐温-20消毒后用无菌水冲洗3次后，方可接种。
（2）果实及种子消毒：果实和种子根据清洁度，用自来水冲洗10min～20min，甚至更长时间。再用纯酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠溶液浸10min后，再用无菌水冲洗2次～3次，就可取出果实内的种子或组织进行培养。种子则要先用10%次氯酸钠浸泡20min～30min甚至几小时。对难以消毒的还可用0.1%氯化汞溶液或1%～2%溴水消毒5min。进行胚或胚乳培养时对于种皮太硬的种子，可先去掉种皮，再用4%～8%的次氯酸钠溶液浸泡8min～10min，经无菌水冲洗后，即可取出接种。
（3）根及地下部器官的消毒：根和地下部器官生长于土中，消毒较为困难。除预先用自来水洗涤外，还应用软毛刷刷洗，用刀切去损伤及污染严重部位，吸水纸吸干后，再用纯酒精漂洗。可采用0.1%～0.2%氯化汞溶液浸5min～10min或2%次氯酸钠溶液浸10min～15min，然后以无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干水后可接种。上述方法仍不见效，可将材料浸入消毒液中进行抽气减压，以帮助消毒液的渗入，达到彻底消毒的目的。有报道，用12%的过氧化氢+0.1%氯化汞溶液混合液对生姜灭菌10min效果很好。
3.培养基
培养基制作如项目二所示，应根据不同的材料，培养基特点，以及植物组织培养要求，在查阅相关文献资料的基础上，通过改变生长素，细胞分裂素等激素的配备，选择合适的植物培养最佳培养基。
4.接种室的消毒
（1）每次接种前半小时应进行地面的清洁工作，并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降。用紫外灯照射20min～30min。
（2）入无菌室前，要洗手去掉指甲中的污物。接种前用70%酒精擦洗工作台面，在操作中要经常用酒精擦洗手，不准讲话，不准对着操作区呼吸，以免微生物污染材料、培养基和用具。然后点着酒精灯，将刀子，镊子，剪子，解剖刀，一次性放入70%酒精中浸泡，灼烧后放凉备用，每次重新操作都要把工具在火焰上重新消毒。
5.无菌操作
左手拿试管或三角瓶等，将试管或三角瓶瓶口靠近酒精灯火焰。瓶口倾斜，右手轻轻取下封口膜或棉塞，将瓶口在灯焰上旋转灼烧，然后用镊子将外植体送入瓶中，材料在培养瓶内的分布要均匀，茎尖、茎段等基部插入固体培养基中，叶片通常将叶背接触培养基，这是由于叶背气孔多，利于吸收水分和养分。镊子灼烧后放回支架或浸入消毒的酒精中，这时将瓶口在火焰上灼烧数秒钟，棉塞或封口膜也在火焰上燎数秒钟，塞回瓶口或用封口膜封口，所有的材料接种完毕后，做好标记，注明材料接种名称、接种日期、接种人。
6.定期检查和观察
进行培养的材料应定期检查，特别是接种后的3d～7d内要全天检查，主要是检查其污染情况，发现污染材料，应及时处理掉，最后一直没有污染的就是得到的无菌材料，再通过它们的生长增殖，并通过继代培养就建立了无菌培养系。
【作业】
1.请分析为什么消毒植物材料时，最少用两种以上的消毒液处理植物材料？
2.有茸毛的植物材料在消毒时，为什么在消毒液中加入几滴吐温？请分析原因。
3.对于含有内生菌的植物材料如何进行消毒灭菌？
4.请认真填写本项目实训报告单。
