验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证实验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。
菌种对实验菌种的要求同细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。
大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］
金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus）［CMCC（B）26003］
乙刊副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）［CMCC（B）50094］
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］
生孢梭菌（Clostridium sporogenes）［CMCC（B）64941］
白色念珠菌（Candida albicans）［cMcc（F）98001］
（二）菌液制备
接种大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24h。用0．9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含苗数为10—lOOCFU的菌悬液。
（三）验证方法
（1）实验组取规定量供试液及10～100CFU实验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。
（2）阴性菌对照组设立明性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同实验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。
（四）结果判断
阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若实验组检出实验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若实验组未检出实验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活悱，并重新进行方法验证。
验证实验也可与供试品的控制菌检查同时进行。
（五）检查法
供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制茵检查方法的验证。
1．阳性对照实验
进行供试品控制苗检查时，应做阳性对照实验。阳性对照实验的加菌量为10～100CFU，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照实验应检出相应的控制菌。
2．阴性对照实验
取稀释液lOml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对麒应无菌生长。
（1）大肠埃希菌取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm的平方），直接或处理后接种至适量（不少于100ml的乳精胆盐培养基中，培养18～24h，必要时可延长至48h。
取上述培养物0．2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5h、24h在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MuG阳『丰；不早现荧光，为MuG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，被面呈攻瑰红色，为靛基质阳性；旱试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MuG阴性和靛基质阴性。
如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，削供试品未检出大肠埃希菌；如MuG阳性、靛基质阴性，或Muc阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18—24h。
若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表4—16所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若乎板上生长的菌落与表4—16所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化实验，确认是再为大肠埃希菌。
表4—16大肠埃希菌菌落形态特征
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培养基菌落形态
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曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红公，菌落中心呈深
紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表
面光滑，湿润，常有金属光泽。
麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，
边缘整齐，表面光滑，湿润
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（2）大肠菌群取含适量（不少于10ml）的乳糖胆盐发酵培养基管3支，分别加入1：10的供试液lml（含供试品0．1g或0．1m1）、1：100的供试液1ml（含供试品0．01g或0．01m1）、1：1000的供试液1ml（含供试品0．001g或0．001ml），另取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养18～24h。
乳糖胆盐发酵管若无菌牛长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24h。
若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表4—17所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与表4—17所列的菌落形态特征相符或疑似。且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证实验。
表4—17大肠菌群菌落形态特征
确证实验：从上述分离平板上挑选4～5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵营中，培养24～48h。若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。
根据大肠菌群的检出管数，按表4—18报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。
表4—18可能的大肠菌群数表
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各供试品量的检出结果可能的大肠菌群数N
_____________________________________（个／g或ml）
0．1g或0．01g或0．001g或
0．1ml 0．01ml 0．001ml
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+++＞10的粒方
++-10的平方＜N＜10的粒方
+--10＜N＜10的平方
---＜10
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（3）沙门菌取供试品1Og或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养18—24h。
取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24h后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养18—24h（必要时延长至40～48h）。若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于表4—19所列的特征，判供试品未检出沙门菌。
若平板上生长的菌落与表4—19所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2～3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24h，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化实验和血清凝集实验，确认是否为沙门菌。
（4）铜绿假单胞菌取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm的平方），直接或处理后接种笔适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24h。取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲镀琼脂培养基的平板上，培养18～24h。
铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2—3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24h。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶实验。
①氧化酶实验：取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配制的1％二盐酸二甲基对苯一胺试液，在30s内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶实验阳性，否则为阴性。
若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶实验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素实验。
②绿脓菌素实验：取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24h，加三氧甲烷3—5ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1moL盐酸试液约1ml，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素实验阳性，否则为阴性。同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照实验应呈阴性。
若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶实验阳性及绿脓菌素实验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶实验阳性及绿脓菌素实验阴性，应继续进行适宜的生化实验，确认是否为铜绿假单胞菌。
