微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母茵数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。防止污染的措施不得影响微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23—28℃；控制菌培养温度为35—37℃。
检验结果以1g、1ml、10g、lOml或10cm的平方。为单位报告。
检验量即一次实验所用的供试品量（g、ml或cm的平方）。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；化学膜剂为100cm的平方；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加120g或20ml。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。
一、供试液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1h。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如F。
（一）液体供试品
取供试品10ml，加pH 7．0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原渡作为供试液。
（二）固体，半固体或黏稠性供试品
取供试品10g，加pH 7．0无菌氧化钠一蛋白胨缓冲液至100m1，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
（三）需用特殊供试液制备方法的供试品
1．非水溶性供试品
方法1：取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7．0无随氯化钠一蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20的供试液。
方法2：取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见《中国药典》二部附XIH无菌检查法中供试品的无菌检查项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的DH 7．0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10min，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液。
2．膜剂供试品
取供试品100cm的平方，剪碎，加pH7．0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液100ml（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1：10的供试液。
3．肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品10g，加pH6．8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7．6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1：10的供试液。
4．气雾剂、喷雾剂供试品
取规定量供试品，置冰冻室冷冻约lh，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7．0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1：10的供试液。
5．贴剂供试品
取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴而以避免贴剂粘贴在起。然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酸80或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30min，制成供试液。贴剂也可采川其他适宜的方法制各成供试液。
6．具抑菌活性的供试品
当供试品有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下。
（1）培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的莆数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的甲均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。
（2）离心沉淀法取一定量的供试液，3000r／min离心20min（供试液如有沉淀，先以500r／min离心5min，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。
（3）薄膜过滤法见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。
（4）中和法凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。
二、细菌、霉苗及酵母苗计数
（一）计数培养基的适用性检查
细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配置的培养基均应检在。
（二）菌种
验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证实验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］
白色念珠茵（Candida albicans）［CMCC（F）98001］
黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］
（三）菌液和备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琉脂培养基中，培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24—48h。上述培养物用0．9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3～5ml含0．05％（ml／ml）聚山梨醋80的0．9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0．05％（ml／ml）聚山梨配80的0．9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢于数50～100CFU的孢子悬液。
（四）验证方法
验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各实验菌每次实验的回收率。
1．实验组
平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试渡1ml和50～lOOCFU试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50—100CFU试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。
2．菌液组
测定所加的试验菌数。
3．供试品对照组
取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
4．稀释剂对照组
若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制各过程中微生物受影响的程度。实验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50～100CFU，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70％。若实验组的菌回收率（实验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70％，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次实验中实验组的菌回收率低于70％，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
验证当最低稀释级的供试液含有抑菌活性，且采用上述消除抑菌活性的方法后试验菌的回收率还无法达到计数方法验证的要求时，根据供试品的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，可采用高一稀释级的供试液重新进行回收率的测定。若试验菌的回收率符合计数方法验证的要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行试验。
验证实验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。
（五）检查法
计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。
取按验证的方法制备的均匀供试液，用pH7．0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液稀释成1：10、1：10的平方、1：10的粒方等稀释级。
1．平皿法
采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。
取供试液1ml．置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
（1）阴性对照实验取实验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。
（2）培养和计数除另有规定外，细菌培养48h，逐日点计菌落数，一般以48h的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72h，逐日点计菌落数，一般以72h的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至5～7天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的苗落数不能相差1倍或以上。
一般营养琼脂培养基用于细蘸计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，别应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母苗数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养墓中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。
含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。
（3）菌数报告规则宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌平均菌落数在30～100之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。①当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。②当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。③当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。④如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
2．薄膜过滤法
采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0．45μm，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。
取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g或1ml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用pH7．0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。
（1）阴性对照实验取实验用的稀释渡1ml，照上违薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。
（2）培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100个。
（3）苗数报告规则以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以<1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品）或<l乘以稀释倍数的值报告菌数。
三、控制菌检查
（一）控制菌检查方法的验证
当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。
