一、镇痛药物概述
疼痛的物质基础是神经系统的活动，基本形式是活体组织细胞受到刺激之后，产生动作电位，形成神经冲动。它既是物质的变化，属于生理学范畴，同时又伴随着心理反应，是精神现象，因为疼痛是主观感觉。为了对疼痛进行评估，世界卫生组织将疼痛程度进行了划分。0度：不痛；Ⅰ度：轻度痛，为间歇痛，可不用药；Ⅱ度：中度痛，为持续痛，影响休息，需用止痛药；Ⅲ度：重度痛，为持续痛，不使用药不能缓解疼痛；Ⅳ度：严重痛，为持续剧痛伴血压、脉搏等变化。
由于疼痛是一种因组织损伤或潜在的组织损伤而产生的痛苦感觉，还常伴有不愉快的情绪甚或心血管和呼吸方面的变化，镇痛药物相应而生。主要包括通过激动中枢神经系统特定部位的阿片受体，而产生镇痛作用，并同时缓解疼痛引起的不愉快情绪的药物。因其镇痛作用与激动阿片受体有关，且易产生药物依赖性或成瘾性，易导致药物滥用及停药戒断症状，故称阿片类镇痛药或麻醉性镇痛药、成瘾性镇痛药。药物的镇痛作用主要是作用于中枢神经，选择性抑制痛觉，缓解和制止疼痛。包括麻醉性镇痛药、非麻醉性镇痛药、解热镇痛药及局麻药。目前使用的镇痛药物主要有：阿片受体激动药（吗啡、可待因、哌替啶、美沙酮、芬太尼等）、阿片受体部分激动药（喷他佐辛、布托啡诺等）、其他镇痛药（曲马多、罗通定等）。
针对疼痛的成因、反应程度以及药物作用的情况，多采用神经源性或神经病理性实验动物疼痛模型，常用的致痛方法有物理性（热、冷、电、机械）和化学性刺激。常使用的实验动物有小白鼠、大白鼠、豚鼠、兔、犬等，动物实验中常用的反应指标为嘶叫、舔足、甩尾、挣扎、表皮和肌肉的抽搐等。
二、镇痛药物主要药效学研究
（一）热刺激法
本方法系利用一定强度的温度来刺激动物躯体的某一部位，使其产生疼痛反应，一般热刺激强度应在45～55℃之间为宜，低于此范围不会产生明显的痛觉，而高于此范围可能灼伤动物。因此，对于强效的镇痛药物，刺激强度可大一点，弱效药物则强度应选择较低一些，以刺激开始到出现痛觉反映的时间为潜伏期，作为测痛指标评价药效。目前最常采用辐射热刺激法和小鼠热板法。
1．辐射热刺激法（光热法）
（1）实验原理利用聚光灯高热量光源产生的一定强度的光束，经聚光装置聚焦照射动物躯体的指定部值产生痛觉，大鼠、小鼠以甩尾为痛反应指标，兔以甩头为痛反应指标。
（2）实验装置可直接采用辐射热刺激仪器，也可使用小型聚光灯（22V，250W，16mm电影放映灯泡）产生光束，使用外罩的聚光漏斗或凸透镜等装置使光束焦点照射到测痛部位。照射管束强度应可调节，并可随时关闭光束。
（3）实验方法
①大鼠、小鼠辐射热甩尾法：取体重200g左右大鼠（一般选用雄性SD）或体重20g左右雄性小鼠，实验前检查尾部无伤，置于鼠固定装置中，尾部露出，自然下垂，待鼠安静后即可实验。实验前将仪器装置调整好，使热辐射光焦点照射在鼠尾约相同部位，用计时装置记录从照射开始到动物疼痛甩尾的时间作为潜伏期（TEL），即痛阈。调节光照射强度，选用在5s以内引起甩尾反应的热辐射强度为益。
给实验前可对鼠尾进行清洁，并在尾部下1／3处标记，每次测量时均照射此部位。给药前可连续测定3次，每次间隔5min，取平均值为基础阈值（对照潜伏期）。用药后测定时，应设立阴性对照（或溶剂对照）组同时进行实验，如动物10s仍不甩尾则光照停止，以免烫伤，也可在TEL升高100％（小鼠）、150％（大鼠）时停止照射。按实验要求间隔一定的时间再次测试，以测定药物镇痛作用的时效关系。按下公式计算镇痛反应百分率和痛阈提高百分率，用以评定药物的镇痛强度。
镇痛反应率％＝（给药后TEL－基础TEL）／（光照截止时间－基础TEL）×100％
痛阈提高率％＝（给药后TEL－基础TEL）／基础TEL×100％
注：实验中有光照截止时间可选择镇痛反应百分率公式进行计算，如在TEL升高100％（小鼠）、150％（大鼠）时停止照射，可选择痛阈提高百分率公式进行计算。
②兔鼻部或嘴角辐射热甩头测痛法：选取体重2kg左右的家兔，实验时用布兜将家兔悬起。在鼻部或嘴角附近剪毛，用墨汁划出测痛的区域（使之易吸收热），以辐射热照射引甩头的反应时间作为痛阈。实验开始时，测定2～3次痛阈（每次刺激不超过30a），以其平均值为100％。
为避免皮肤灼伤，用药后若痛阈升高超过基础痛阈的200％，应停止照射（例如基础痛阈为15s，则照射时间不超过45s），并以200％作为最大值。正常值参数：7s±0．3s。
③豚鼠背部皮肤辐射热测痛法：选用体重为250g±20g英国短毛种豚鼠，实验前一日用脱毛剂将背部脱毛，脱毛面积3cm×3cm为宜，使用光照仪器给裸露皮肤以热刺激，以皮肤或肌肉抽搐颤动为痛反应。可在实验中用活性炭或墨汁涂黑皮肤，以增加热吸收，降低痛反应阈值，减小对动物皮肤的伤害。
（4）注意事项
①光热刺激鼠尾法：常选用尾部的下1／3处作为测痛点，但反复连续测定时，需将测痛部位稍加移动，防止局部烫伤而影响测痛结果。为考察药物镇痛的时效关系，可以多次测量，但测量次数不宜过多。若阴性对照组TEL变化较大，则统计时不仅要与基础痛阈进行比较，还要与阴性对照组对应时间的痛阈进行比较才能较准确地评价镇痛药效。
②由于鼠尾表面积很大，易于散热，因此正常时大鼠尾温同室温相近。若是室温明显改变时，尾温发生相应变化，随着尾温的升高，则甩尾阈值降低。故实验研究时，最好将室温保持在20℃±1℃。
③给药前测试痛阈，如反应时间少于2s或大于10s，表示该动物反应过敏或迟钝，则剔除不用。
④实验应同时进行，以免动物日反应不一致影响实验结果。
（5）方法评价光热法是一种优越类型的刺激法，仪器装置简单，反应灵敏，若固定照射时间能标准测出阈值及刺激强度。光热法不仅能刺激大、小面积的皮肤，对不规则的皮肤表面亦能刺激，而且光刺激的重复性好，亦不损害皮肤表面。此外，本法对筛选麻醉性镇痛药及非麻醉性镇痛药均适用。
光热法中以大鼠甩尾法比较灵敏，反应恒定，操作方便，因此使用较多。但由于甩尾反应只是一种脊髓反射，因此骨髂肌松弛药也会出现阳性结果，应加以注意。
2．小鼠热板法
（1）实验原理实验中将雌性小鼠放在加热到55℃的金属板上。以舔后足、踢腿、跳跃等作为痛反应的指标。其中舔后足为动物最不常态动作，因此被作为疼痛的反应明确指标。
（2）实验装置热板仪或其他可控温度的适宜装置。
（3）实验方法选择体重20g左右的雌性小鼠，放在预热至50～55℃的金属板上，实验过程中保持恒温（温度变化±0．5℃），以小鼠舔后足反应或者跳跃反应的潜伏期作为痛阈指标，实验时以其中一个为测试指标。实验前应筛选动物，选择反应潜伏期在5～30s的动物进行实验，测定动物反应时间作为基础阈值，可测定2～3次，取平均值，间隔时间5min。为防止足部烫伤，在60s或基础阈值2倍时间时可停止。
（4）注意事项
①热板法个体差异较大，实验动物进行挑选，过分灵敏和迟钝的动物应剔除不用。动物对热板刺激反应也有不同表现，主要反应为舔足，所以常被作为痛反应指标。有些动物反应为跳跃，有些为快速行走等，舔足为保护性反应，跳跃为逃避性反应，其他的反应因不适观察和界定，可在筛选时剔除。
②雄性小鼠在热板实验中可因阴囊下垂而受到刺激，影响结果，所以选择雌性小鼠。
③室温应保持恒定为宜，动物对痛反应时间波动较小。
（5）方法评价本法装置简便，指标明确，对组织损伤最小，动物可反复利用，并且痛反应潜伏时间较长，便于观察及测出药物之间的较小差异，以利于比较药物镇痛作用的强弱、快慢及持续时间，故为目前比较常用的方法之一。
3．小鼠热水缩尾法
实验方法：将小鼠尾部浸入45～55℃恒温水浴内，浸入长度为3cm，以尾部上抬出水面的潜伏期作为镇痛指标。给药前测2次以其均值作为基础阈值，测定间隔为5min。
本实验法对麻醉性镇痛药物与环氧酶抑制剂缓解不同水浴热刺激有明显差别，且与临床不同强度的镇痛药疗效大致平行。可作为评定各种镇痛药物的临床前效应强度的一种方法。
热刺激方法以反应潜伏期进行痛阈高低的定量，数据统计方法相似，均可采用t－检验或方差分析法。欲求药物镇痛效应的ED（下标50）和ED（下标95），均可按某一动物用药后痛阈值大于阴性对照组相应时间点痛阈均数加上3个标准差，判定为有效，进行数据转换，再用几率单位法等方法计算。
（二）电刺激法
本法系用一定参数的电流或电压通过皮肤或经电极导入组织兴奋区产生出入放电引起疼痛反应，并根据刺激阈值（电压、电流强度）变化来评价药效。本法的优点是无论药物药效强弱都能把镇痛效应表现出来。缺点是组织的阻抗易发生改变而不易控制，并且电刺激法敏感性不高，其反应的变化与年龄、性别、种族、用药前阈值及其他多种因素有关，因此点刺激法对药物镇痛效果的评价并不是十分准确的。
1．齿髓刺激法
目前公认牙髓神经是对疼痛很敏感的刺激部位，此法使用于大鼠、犬、猫、兔等动物。
（1）基本原理通常牙髓仅有痛觉，牙髓传入纤维主要传导伤害性信息，对牙髓的刺激可看作是“纯痛”刺激。
动物于麻醉状态下在牙齿上钻孔，再把电极插入齿髓，制成慢性埋藏电极。电刺激时，动物因疼痛会出现咀嚼运动等张颌反应，可将此时的电刺激强度作为痛阈的指标。
（2）实验方法本实验以大鼠为例。选择200～300g体重SD大鼠，戊巴比妥钠麻醉后，在牙颈区作一2mm横切口以暴露一侧下颌骨和门牙。用微型牙钻在牙骨－釉质变界出钻一个小孔，相距1．5mm处再钻一个穿过下颌骨的孔，两孔均应偏离中轴以免损伤神经和血管。将剥去绝缘层的不锈钢或铂金电极从孔中穿过，使无绝缘层在下颌骨内，并在一端打结，防止电极脱落；另一端（带有绝缘层）连接到小塑料双极接线盒，接线盒固定于头顶或颈背部。术后7～10天内可以进行镇痛实验。
实验开始前可让动物自由放松活动。实验时先由阈下刺激，然后每次递增5V，直到出现阈反应。本法能测定药物作用的强度、发生及持续时间。
（3）方法评价
①齿髓刺激法作为模拟病理性疼痛是一种敏感而有价值的方法，所测得的药物最小有效剂量与临床镇痛剂量相关，是评价阿片类和非阿片类镇痛药的可靠方法。
②该动物模型可反复使用，对多次给药可累加剂量并表现量效关系曲线，如用于不同药物，则需要间隔数天后，待药物完全消除方可使用。
③本实验易使动物发生条件反射，实验中要与阴性对照、模型对照进行比较。
2．大鼠、小鼠尾刺激法
实验方法：选体重250～350g的大鼠（18～22g小鼠），固定，使之不能自由活动而尾部露在外。用75％乙醇擦去尾上皮脂，待乙醇挥发后，用方波脉冲电流刺激器进行电刺激（也可在尾上涂一均匀薄层的导电胶，以增加刺激、降低阈值）。刺激参数为：电压20V±1V，频率60～100Hz，波宽0．5ms，串长50～100ms（小鼠刺激参数：电压3～8V，频率60Hz），以引起甩尾和嘶叫反应的电流强度（mA）作为痛反应指标，每5min测定1次，连续刺激3次，取均值作为“甩尾阈”和“嘶叫阈”的基础痛阈。给药后用上述强度重复刺激，凡连续刺激二次不嘶叫者，表示药物有镇痛作用，计算镇痛效应百分率。注意每次刺激不超过10s，防止组织损伤。
上述实验也可采用大鼠自由活动下测量方式。将大鼠安置于适当大小有机玻璃盒内，可自由活动，尾部插入两根针状电极，以柔软导线连接，并以适当方式固定，用直流串脉冲波宽1ms、频率50Hz、串长500ms进行刺激，由0开始，每次递增0．25mA，直至动物发出嘶叫声，间隔5min刺激一次，直至四五次数值稳定不变，作为基础阈值。给药后5、10、30min与1、2、3、4与5h测试嘶叫阈值，求出镇痛效应百分率。
此外，可采用电刺激小鼠甩尾法和电刺激兔耳法。
3．电刺激内脏大神经的慢性测痛法
（1）实验方法兔（2～3kg），雌雄不限，用聚四氟乙烯绝缘多股银丝作双极电极，于麻醉下无菌操作埋植于左侧内脏大神经上。手术后一周开始实验，将动物置于兔盒内，头部和四肢可以自由活动，待动物适应环境安静后，开始刺激内脏大神经，测定痛阈。刺激参数为短串单向方波，串长500ms，波宽1ms，频率40Hz，强度为每隔5s递增约0．1mA，至刺激强度增强至一定值时，兔即出现行为反应，多数表现为前肢搔爬或收缩，仰头或头向一侧转动，有时前肢活动和头转向同时出现，少数兔会引起全身性活动反应。以引起行为反应的最小刺激电流强度作为内脏痛阈值，每隔5min测一次，共测3次，以均数作为每一次实验的基础阈值。
（2）方法评价
①从组织学和生理资料证明内脏大神经在传导内脏感觉，包括内脏痛觉有重要作用。
②大内脏神经重复电刺激能较精确定量，也易引起较稳定的痛反应。
③实验动物能被重复利用，一般能维持一个月以上供做实验观察。此法为一个较好的观察内脏痛的慢性实验模型。
（三）机械刺激法
通过一定的机械力量对动物尾部、足部及其他部位进行压、刺等痛觉刺激来测定药物镇痛效果的方法。
1．大鼠尾尖部压痛法
（1）实验装置鼠尾压痛仪器。
（2）实验方法一般鼠龄3～6周的大鼠需400～500mmHg的压力，较大动物则需要加至600～800mmHg，以产生嘶叫作为痛阈值。实验时，连测二次，取平均值作对照值。给镇痛药后，每30min重测痛阈一次，共三次。计算痛阈提高百分率以比较镇痛强度。
（3）注意事项
①本法实验结果与大鼠年龄关系很大，以选用100～150g体重大鼠为宜。
②压痛部位通常选用敏感性较高的尾尖端1／3处。
2．小鼠尾部根部压痛法
（1）实验方法一般使用相应的测痛仪器，将小鼠适当固定，尾根部置于压片或压丝下，逐渐增加压力，至动物出现因疼痛而缩尾或全身退缩反应作为痛阈指标，以此法操作测定痛阈提高率来评价药效。
痛阈提高率（％）＝（给药后痛阈－基础痛阈）／基础痛阈×100％
（2）注意事项
①实验时，对痛反应过于敏感或迟钝的动物应予以剔除。
②小鼠固定应能保证其在实验过程不在固定器内部翻滚。
