（5）对胆固醇吸收和合成等过程的影响体内胆固醇水平有两个来源：经肠腔的再吸收和内源性合成。通过乙酰辅酶A的抑制物胆固醇乙酰转移酶（ACAT）可降低胆固醇的吸收。胆固醇吸收的抑制则可导致肝脏3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶A（HMG－CoA）还原酶活性增加。该酶活性可被HMG－CoA还原酶抑制剂降低。
雄性Syrian黄金仓鼠，体重100～120g。每组6只。应用前1周给予低胆固醇饲料。连续给予受试药物4天。于第4天上午9点给动物脂类饲料，其中含有［（上标3）H］胆固醇15mg，7．5mg胆酸，以测定胆固醇吸收。于第5天上午9点（此时为每日HMG－CoA还原酶和胆固醇7α－羟化酶活性的峰值时间）麻醉动物，经心脏穿刺取血，以测定血浆胆固醇和甘油三酯水平以及胆固醇的吸收。切下肝脏，称重，以冰冷的生理氯化钠溶液冲洗干净，用于测定肝脏胆固醇含量，以及HMG－CoA还原酶、胆固醇7α－羟化酶活性，并测定肝脏LDL受体水平及胆固醇吸收情况。
3．抑制胆固醇生物合成和胆固醇吸收
（1）胆固醇生物合成的抑制人体内胆固醇总量的70％以上是由体内生物合成的。HMG－CoA还原酶是控制哺乳动物细胞胆固醇合成的限速酶。能促使HMG－CoA还原成甲羟戊酸，成为合成胆固醇的中间体。当肝脏HMG－CoA还原酶被抑制时，抑制物触发了肝脏LDL受体产生的增加。当LDL受体活性增强时，更多LDL从血液中转移到肝脏，因而导致循环中LDL胆固醇水平的降低。
①体外HMG－CoA还原酶的抑制：利用从大鼠肝脏制备的微粒体研究实验药物对HMG－CoA还原酶的抑制作用。50μl纯化的HMG－CoA还原酶。缓冲液：35mmol／L Tris，10mmol／L EDTA，10mmol／L DTT，pH7．5。910μmol／L HMG－CoA溶液20μl中含有100Ci（上标14）C－HMC－CoA和20μl NADPH再生系统（52mmol／L葡萄糖－6－磷酸，1U葡萄糖－6－磷酸脱氢酶，5．2mmol／L NADP），NADPH的实际浓度为50mmol／L。终体积为200μl，37℃孵育20min。加入2mol／L HClO（下标4）75μl终止反应。室温下放置60min后，在冰盒中冷却样品，加3mol／L醋酸钾中和反应，加蒸馏水至500μl，离心沉淀。取上清液250μl，加入0．6cm×8．0cm BioRad AGl－X8柱子中。甲羟戊酸内酯用水洗脱，丢弃开始的750μl液体。收集之后流出的3500μl。洗脱液中的500μl加入闪烁瓶中，在闪烁仪上计数。进行有或无抑制剂存在时抑制活性均值的比较，并计算IC（下标50）。
②抑制离体于细胞胆固醇中（上标14）C乙酸钠的掺入：测定离体肝细胞中原位合成的胆固醇中掺入的标记乙酸盐的含量。此合成反应可被HMG－CoA还原酶抑制剂所抑制。雄性大鼠肝细胞或人肝癌原代培养细胞单层在脂蛋白缺乏的介质中培养1h，介质中含有不同浓度的HMG－CoA还原酶抑制剂和标准物。将（上标14）C标记的乙酸钠加入到介质中，继续培养3h或24h。部分培养的细胞中加入内标（上标3）H－胆固醇。用强碱皂化细胞，这些皂化的细胞的脂质利用三氯甲烷／甲醇提取。脂质混合物经薄层色谱仪分离。合成新的（上标14）C胆固醇的含量用液闪仪测定。计算每毫克蛋白新合成的胆固醇的含量。与药物溶媒对照进行比较，评价受试药物的抑制活性，根据不同受试药物浓度的实验结果结算IC（下标50）。
③大鼠肝脏切片中胆固醇体内生物合成的抑制作用：口服HMG－CoA还原酶抑制剂后，利用标记的锌酸钠合成胆固醇的方法，在体分析测定大鼠肝脏胆固醇生物合成的抑制作用。雄性SD大鼠，110～130g。将动物饲养在有光照循环的室内14天。在此期间大鼠自由摄取低胆固醇饲料。实验当天，于上午口服给予受试药物。1h后处死动物，去肝脏，置于冷的氧饱和Krebs－Ringer碳酸氢盐缓冲液中。然后将肝脏切成0．8m㎡的组织块，悬浮于上述缓冲液中。将悬浮液分成3份移入含有（上标14）C锌酸钠的培养管中，体积为1ml。培养管通以95％氧和5％二氧化碳混合气10s。加盖后于37℃在振荡器上，以每分钟150次振荡90mm。以加入1ml溶于乙醇中的15％氢氧化钾终止反应。加入内标（上标3）H胆固醇。培养管于75℃皂化2h，然后用10ml石油醚提取30min。将水相冷冻于干冰／乙醇的混合物中。醚相用2ml蒸馏水冲洗，然后蒸发干燥。用薄层色谱仪分离合成的（上标14）C胆固醇。切下胆固醇斑点，用液闪仪进行放射性活性计数。结果以抑制百分率表示，与赋形剂对照组比较，根据量效曲线计算机制作用的ED（下标50）。
④体内HMG－CoA还原酶抑制剂的作用：雄性WHHL家兔，1．8～2．5kg，8～20周龄。受试药物每日下午经灌胃给予，以保证夜间血浆水平较高，这是因为HMG－CoA还原酶活性夜间高于白天。连续给药14天。实验前5天及给药后3天、8天，停药后30天分别于早晨空腹由耳缘静脉取血2ml，测定生化指标。此外，于给药第1天、最后1天及停药后10天取血6ml，测定脂蛋白。将血液在室温下凝固，10000r／min离心。将未冷冻的血样进行总胆固醇、HDL、甘油三酯、肌酸、总胆红素、碱性磷酸酶、丙氢酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸转移酶（AST）以及γ－谷氨酸转移酶。将每只动物处理前5天和当天测得的数据合并，计算均值为对照，统计学分析各组均数之间的差异。
（2）抑制胆固醇吸收胆固醇酰基转移酶（ACAT）可催化细胞内胆固醇酯的形成。它在肠道吸收胆固醇、动脉壁泡沫细胞的形成和肝脏VLDL的产生中均起着重要的作用。ACAT抑制剂除了可抑制胆固醇的吸收外，也具有潜在的作用。肝脏ACAT的抑制可能引起胆固醇酯生成的减少，而动脉壁中ACAT的抑制可减少胆固醇酯在粥样硬化损伤中的沉积。
①体外ACAT的抑制作用：家兔喂饲含2％胆固醇＋10％红花油的饲料6周，处死动物，制备兔肝或肠微粒体。微粒体蛋白0．2mg，去脂肪酸小牛血清白蛋白3mg／ml，0．04mol／L KH（下标2）PO（下标4）缓冲液，pH 7．4。用DMSO稀释药物（总体积200μl中含DMSO 5μl）。以加入50μmol／L的（上标14）C十八碳烯辅酶A启动反应。反应3min后，加入2：1的三氧甲烷和乙醇终止反应。（上标3）H胆固醇十八碳烯酸盐作为内标。将脂质提取物溶解在三氯甲烷中，点样于TCL平板，在80：20：1的己烷－石油醚－乙酸中跑板。未标记的胆固醇油酸盐加到内标中，协助碘蒸气使条带显现。刮下胆固醇酯条带，加入液闪瓶中，于液闪仪上测定放射性。对每一化合物分别以4个不同浓度进行评价，每一浓度设立两个平行样。计算IC（下标50）。
②在体ACAT抑制活性的测定：雄性SD大鼠，200～225g。给予高脂饲料喂养一周。同时设立受试药物给药组和对照组。实验最后一天，早上8点禁食，下午2点尾静脉注射同位素（上标3）H胆固醇。下午3点重新开始进食，同位素注射后48h活杀动物。通过血浆所含同位素的比率计算吸收的胆固醇占口服剂量的百分比。（口服给药剂量／2ml血浆）／（静脉给药剂量／2ml血浆）×100％。
（二）动脉粥样硬化模型的病变检测
1．动脉内皮损伤和功能改变的检测
（1）内皮损伤后的内膜反应雄性2～2．5kg新西兰兔或350～400g SD大鼠，于麻醉状态下暴露右侧股动脉，在X光照射下插入栓子切除术导管，直到主动脉弓，充气，将导管拉至髂动脉分叉处，放气取出。其中一部分动物与48h后静脉注射（上标3）H胸苷，45min后处死，取出主动脉，剥取内膜，制成匀浆，用二甲胺法测定DNA，用液体闪烁计数器测量掺入的（上标3）H。另一部分动物用于组织学检查，于导管术两周后静脉注射肝素500U／kg并处死，经颈动脉套管以恒压注入固定液，固定主动脉压60min。然后对上、下腹主动脉及其中间的内膜增生作定量观察。将受试药物组与对照组动物（上标3）H掺入及内膜增生情况进行比较。
（2）动脉粥样硬化兔内皮功能测定动脉粥样硬化的兔主动脉损伤及其对乙酰胆碱的内皮依赖性松弛，以此测定药物的防治效果。取用药、不用药的动脉粥样硬化兔和正常兔，分别用戊巴比妥钠麻醉后，取出近端胸主动脉切成2mm宽的动脉环，剪断成条，悬浮于充满缓冲液（NaCl 113．8mmol／L、NaHCO（下标3）20mmol／L、KCl4．7mmol／L、KH（下标2）PO（下标4）1．2mmol／L、CaCl（下标2）2．5mmol／L、葡萄糖5．5mmol／L）浴皿中，37℃，缓冲液通以95％氧气＋5％二氧化碳混合气体，使pH为7．4。2h后，当收缩张力稳定时加入去甲肾上腺素，终浓度为1×10（上标－8）mol／L，血管条呈现稳定的次量强度收缩。然后加入乙酰胆碱，从1×10（上标－8）mol／L逐次以10倍的剂量增加，至终浓度为10（上标－5）mol／L。动脉条的松弛以收缩的降低百分比表示。
2．主动脉斑块的病变分级
一般动物模型的病变首先呈现于主动脉，动物处死后，取主动脉，与背侧面纵行切开，肉眼观察斑块，或先将其上的脂肪组织去除，用10％的甲醇溶液固定，苏丹Ⅳ染色，使斑块呈红色再行观察。若称重，算出斑块面积或重量所占动脉壁的百分率，按以下规定进行分级：0级：无病变；Ⅰ级：病变占1％～25％；Ⅱ级：病变占26％～50％；Ⅲ级：病变占51％～75％；Ⅳ级：病变占76％～100％。
3．冠状动脉病变分级
将心脏取出用10％甲醛溶液固定，再将心脏横切成3块，每块至少冰冻切片2片，用苏丹Ⅳ及苏木素染色，每切片一般观察10个动脉断面，并以下列标准分级：0级：冠脉内膜无脂质浸润；0．5级：内膜有轻度脂质浸润；1级：内膜斑块占管腔面积＜1／4；2级：内膜斑块占管腔面积＜1／2；3级：内膜斑块占管腔面积＞1／2；4级：斑块几乎阻塞管腔。
也可将左、右心室及室间隔三部分分别固定、切块、切片染色处理，并计算冠脉病变的等级。此方法亦可用于其他小动脉病变的观测。
（三）肝病变的检测
肝脏系数：即实验动物肝脏重量与体重的比值，或是动物每100g体重含肝重的克数。由于脂代谢紊乱及动脉粥样硬化中肝脏易发生脂肪变性、颜色变黄和细胞肿大，致使肝重增加，因此动脉粥样硬化模型可见肝系数增加。受试药物组对其可能有一定的抑制效应。
肝脏组织学改变：动脉粥样硬化模型的肝脏有脂肪变性和泡沫细胞出现，可根据程度镜检分以下四级。Ⅰ级：正常肝细胞；Ⅱ级：轻度，变性细胞或泡沫细胞数＜25％；Ⅲ级：中度，50％＞变性细胞或泡沫细胞数＞25％；Ⅳ级：重度，变性细胞或泡沫细胞数＞50％。
