一、组织材料的分离
从大鼠体内取出的各种组织均由结合相当紧密的多种细胞和纤维成分组成，在培养液中，1mm的3次方的组织块，仅有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若要获得大量生长良好的细胞，需将组织分散开，使细胞解离出来。
（一）细胞悬液的分离方法
培养材料为血液、胸水和腹水等细胞悬液时，可采用离心法分离。一般用500～1000r／min一的低转速，时间约5～10min。
（二）组织块的分离方法
1．机械分散法
在采用一些纤维成分很步的组织进行培养时，可以直接用机械法进行分散。如脑组织、部分胚胎组织以及一些肿瘤组织等。可采用：剪刀剪切后用吸管反复吹打分散组织细胞；或将组织放在注射器内通过针头压出，但这一方法对组织损伤较大。较常用的是用注射器针芯挤压通过不锈钢筛网的方法。
【实验前准备】
器材：眼科组织弯镊、不锈钢网或尼龙筛（孔径为50目、200目、400目）、10cm培养皿、弯头吸管、注射器。
试剂：培养液、Hanks掖。
【操作步骤】
（1）将组织用Hanks液或无血清培养液漂洗，然后将其剪成5～10mm的3次方的小块，置入50目孔径的不锈钢筛网中；
（2）将筛网放在培养皿中，用注射器针芯轻轻压挤组织，使其穿过筛网；
（3）用吸管从培养皿中吸出组织悬液，置入200目筛网中用上述方法同样处理；
（4）镜检计数被滤过的细胞悬液，然后接种培养，如细胞团块过大，可用400目筛网再滤过一次。
2．剪切分离法
在进行组织移植培养时，可以采用剪切法，即将组织剪或切成小块然后分离培养。
【实验前准备】同机械分散法，但不需要筛网。
【操作步骤】
（1）首先将经修整和冲洗过的组织块（大小约为1cm的3次方）放入小烧杯中，用眼科剪反复剪切组织至似糊状；
（2）用吸管吸取Flanks液或无血清培养液加入到烧杯中，反复轻轻吹打片刻。低速离心去上清，剩下的组织小块即可用于培养。
3．消化分离法
消化法是结生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进步分散的方法。目前较为常用的消化试剂和方法有以下两种。
（1）胰蛋白酶消化法胰蛋白酶是目前应用最为广泛的组织消化分离试剂。适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。但对于纤维性组织和较硬的癌组织效果差。
【实验前准备】
仪器：磁力搅拌器。
器材：眼科弯剪、组织镊、不锈钢筛网（200目）、三角烧瓶（20ml，50ml）、10ml离心管，弯头吸管、注射器、10cm的平方培养皿、培养瓶、细胞计数板。
【操作步骤】将组织剪成1～2mm的3次方左右小块。
置入已事先放有磁力搅拌棒的三角烧杯中，再注入30～50倍组织量并预温到37℃的胰蛋白酶。
放在磁力搅拌器上进行搅拌，一般消化20～60min也可以放入水浴或温箱中，但需每隔5～10min摇动一次。如需长时间，可每隔20～30min取出2／3上清液移入另一离心管冰浴，或离心后去除胰蛋白酶加入含血清培养液。然后再给原三角烧瓶添加新的胰蛋白酶继续消化。
消化完毕后将消化液和分次收集的细胞悬液通过200目孔径筛网滤过，以除掉未消化的大块组织。离心后去除胰蛋白酶，用Hanks液或培养渡漂洗1～2次，最后细胞计数后，按5×10的5次方～1×10的6次方／ml接种培养瓶。
（2）胶原酶法胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型，如消化胰岛采用胶原酶Ⅳ型：胶原酶Ⅱ、可用于肝、骨、甲状腺、心脏等组织；胶原酶Ⅲ对哺乳动物的组织有广泛的消化作用。胶原酶多亏胶原的消化作用很强，仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大，因此，适于消化分离纤维性组织，上皮及癌组织可使上应细胞与胶原成分分离而不受损害。
【实验前准备】
同胰蛋白酶消化法。
【操作步骤】
将漂洗、修剪干净的组织剪成1～2mm的3次方左右小块。
将组织块放入三角烧瓶中加入30～50倍体积的胶原酶，密封烧瓶。
将烧瓶放入37℃水浴或温箱中，每隔3min振摇一次，消化时间与组织类别有关，也可以根据具体情况而定，如组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为消化充分。
收集消化液，离心1000r／min，5min，去上清，用Hanks液离心漂洗1～2次，去上清，加培养液制成细胞悬液，然后细胞计数，接种培养皿。
二、原代培养
原代培养方法很多，最基本和常用的有两种，即组织块法和消化法。
（一）组织块培养法
组织块培养法是一种简便易行且成功率较高的常用原代培养方法，即将组织剪切成小块后，接种于培养瓶。
【实验前准备】
（1）器材眼科剪、眼科镊、培养皿，牙科探针、培养瓶（必要时瓶内可放置小盖玻片），吸管和胶帽，小烧杯（20ml）。
（2）试剂Hanks液，培养液。
【操作步骤】
（1）按前述组织分离方法取材，修剪，将组织块剪成1mm的3次方左右小块。
（2）将修剪好的组织小块，用眼科镊送入培养瓶内。用牙科探针或弯头吸管将组织块在瓶壁上均匀摆置，每小块间距5mm左右。组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置于37℃温箱中。
（3）放置2～4h待组织小块黏附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。
（二）消化培养法
这种方法采用前述的组织消化分离法，将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，易于从外界吸收养分和排出代谢物，可以很快等到大量活细胞也可能在短时间内生长成片。材料与方法同前述组织消化分离法。
