（4）裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1．5ml离心管中，然后在4℃下12000r／min离心5min，取上清分装于0．5ml离心管中并置于－20℃保存。
3．加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（1）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取。
（1）将培养液倒至15ml离心管中，于2500r／min离心5min。
（2）弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500r／min离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
（3）用枪洗干上清后，加100ul裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹弹以使细胞充分裂解。
（4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000r／min离心5min，取上清分装于0．5ml离心管中并置于－20℃保存。
（二）蛋白含量的测定
1．制作标准曲线
（1）从－20℃取出1mg／ml BSA，室温融化后，备用。
（2）取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0，2．5，5．0，10．0，20．0，40．0ug。
（3）按下表在各管中加入各种试剂。
0ug 2．5ug 5．0ug 10．0ug 20．0ug 40．0ug
1mg／ml BSA－2．5ul 5．0ul 10．0ul 20．0ul 40．0ul
0．15／L NaCl 100ul 97．5ul 95．0ul 90．0ul 80．0ul 60．0ul
考马斯亮蓝G－250 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
（4）混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析。
2．检测样品蛋白含量
（1）取足量的1．5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。
（2）取一管考马斯亮蓝加0．15mol／L NaCl溶液100ul，混匀放置2min可作为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按“blank”测空白样品。
（3）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0．5ml），再用无菌水洗一次。
（4）取一管考马斯亮蓝加95ul 0．15mol／L NaCl溶液和5ul待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入干燥的比色杯中按“sample”检测样品。
注意事项：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5ul样品含的蛋白量。
（三）SDS－PAGE电泳
1．清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸少量洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2．灌胶与上样
（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶）。
（2）按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml腔沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型）。
（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3mm使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
（4）按前面方法配4％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
（5）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
（6）测完蛋白含量后，计算含50ug蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0．5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品。）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
（7）加足够的电泳液后开始准备上样（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板）。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样扎中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。）加人下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
3．电泳
电泳时间一般4～5h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
（四）转膜
（1）转一张膜需准备6张7．0～8．3cm的滤纸和1张7．3～8．6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜。这样会阻止膜吸水）。
（2）在加有转移液的搪瓷盘里放人转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以去除里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻地反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很易裂）。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可台起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移渡含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）
（5）将夹子放人转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的周围冰浴以降温。一般用60V转移2h或40V转移3h。
（6）转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。
（五）免疫反应
（1）将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
（2）将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1．5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。
（3）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。
（六）化学发光，显影，定影
（1）将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X线片夹中。
（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X线片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X线片夹，把X线片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X线片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X线片夹，取出X线片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X线片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
注意事项：显影和定影需移动腔片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
（七）凝胶图像分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
