一、基本原理
这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
二、实验前准备
1．仪器
高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、－20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
土器材
各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘，（>20×20cm），X线片夹，X线片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸。
3．试剂
单去污剂裂解液、0．01mol／PBs（pH 7．3）、10％分离胶、4％浓缩胶、G－250考马斯亮蓝溶液、0．15mol／NaCl溶液、2×（5×）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10×丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
试剂配制：
（1）母液
①10mol／L Tris·HCl
Tris（MW121．14）30．29g
蒸馏水200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点，最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室
温下保存。
pH HCl
7．4约17ml
7．5约16m
7．6约15ml
8．0约10ml
②1．74mg／ml（10mmol／L）PMSF
PMSF 0．174g
异丙醇100ml
溶解后，分装于1．5ml离心管中，－20℃保存。
③2mol／L NaH2PO4
NaH2PO4（MW119 98）12g
蒸馏水500ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
④0．2mol／L Na2HPO4
Na2HPO4·12H2O（MW 358．14）71．6g
蒸馏水1000ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
⑤10％SDS
SDS 10g
蒸馏水100ml
50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
⑥10％过硫酸铵（AP）
过硫酸铵0．1g
超纯水1．0ml
溶解后，4℃保存，保存时问为1周。
⑦1．5mol／L Tris·HCl（pH8．8）
Tris（MW121．14）45．43g
超纯水200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至8．8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
⑧mol／L Tris·HCI（pH 6．8）
Tris（MW121．14）15．14g
超纯水200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至6．8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
⑨40％Acr／Bic（37．5：1）
丙烯酰胺（Acr）37．5g
甲叉双丙烯酰胺（Bic）1g
超纯水100ml
37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
⑩20％吐温20
吐温20 20ml
蒸馏水至100ml
混匀后4℃保存。
（2）工作液
①单去污剂裂解液（50mmol／L Tria·HCI pH8．0，150mmol／L NaCl，1％TritonX－100，100ug／ml PMSF）：
1moL／L Tfis－HCI（pH 8．0）2．5ml
NaCl 0．438g
TritonX－100 0．5ml
蒸馏水至50ml
混匀后，4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100ug／ml（0．87ml裂解液加入1．74mg／ml PMSF 50ul）。
②0．01md／L PBS（pH 7．2～7．4）
0．2 mol／L NaH2PO4 19ml
0．2mol／L Na2HPO4 81ml
NaCl 17g
蒸馏水至2000ml
③G－250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）
考马斯亮蓝G－250 100mg
95％乙醇50ml
磷酸
100ml
蒸馏水至1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加人磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤．4℃保存。
④0．15 mol／L NaCl
NaCl（MW58．44）0．877g
蒸馏水100ml
高温灭菌后，室温保存。
⑤100mg／ml牛血清白蛋白（BSA）
BSA 0．1g
0．15mol／LNaCl 1ml
溶解后，－20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0 15 mol／L NaCl进行100倍稀释成1mg／ml，－20℃保存。
⑥10％分离胶和4％浓缩校
10％分离胶（两块胶，10ml）4％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水4．85ml 3．16 ml
40％Acr／Bic（37 5：1）2．5ml 0．5ml
1．5 mol／LTris·HCI（pH 8．8）2．5ml
0．5 moI／L Tris·HCI（pH 6．8）1．26ml
10％SDS 100 ul 50ul
10％AP 50ul 25ul
TEMED 5ul 5ul
加TEMED后，立即混匀即可灌胶。
⑦还原型5×SDS上样缓冲液（0．25mal／L Tris·HCl pH 6．8，0．5mol／L DTT，10％SDS，溴酚蓝，50％甘油）
0．5mol／L HCl·（pH 6．8）2．5ml
二硫苏糖醇（DTF，MW154．5）0．39g
SDS 0．5g
溴酚蓝0．025g
甘油2．5ml
混匀后，分装于1．5ml离心管中，4℃保存。
⑧电泳液缓冲液（25mmol／L Trls，0．25mol／L甘氨酸，0．1％SDS）
Tris（MWl21．14）3．03g
甘氨酸（MW75．07）18．77g
SDS 1g
蒸馏水至1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
⑨转移缓冲液（48mmol／L Tris，39mmol／L甘氨酸，0．037％SDS，20％甲醇）
甘氨酸（MW75．07）2．9g
Tris（MW121．14）5．8g
SDS 0．37g
甲醇200ml
蒸馏水至1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
⑩10×丽春红染液
丽春红S 2g
三氯乙酸30g
磺基水杨酸30g
蒸馏水100ml
使用时将其稀释10倍。
（11）TBS缓冲液（100mmol／L Tris·HCl pH 7．5，150mmol／L NaCl）
1mol／L Tris·HCl（pH 7．5）10ml
NaCl 8．8g
蒸馏水至1000ml
（12）TBST缓冲液（含0．05％吐温20的TBS缓冲液）
20％吐温20 1．65ml
TBS 700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
（13）封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）
脱脂奶粉5g
TBST 100ml
溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。
（14）洗脱抗体缓冲液（100mol／Lβ－巯基乙醇，2％SDS，62．5mmol／L Tris·HClpH6．8）
14．4 mol／Lβ－巯基乙醇700ul
SDS 2g
0．5mol／L Tris·HCl（pH 6．8）12．5ml
超纯水至100ml
配制时，在通风橱内进行。4℃保存。可重复使用1次。
（15）显影波（5×）
自来水（加热至50℃）375ml（以下药品加到温永中）
米吐尔1．55g
亚硫酸钠（无水）22．5g
碳酸钠（无水）33．75g
溴化钾20．95g
补水至500ml
配制时，上述药品应逐一加入。待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至1倍。
（16）定影液
自来水（50～60℃）700ml
（以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）
硫代硫酸钠240g
亚硫酸钠（无水）15g
冰乙酸12．6ml
硼酸7．5g
钾明矾15g（水温冷至30℃以下时再加入）
加水定容至1000ml，室温保存
⑩抗体
用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0．5ml
三、操作步骤
（一）蛋白样品制备
1．单层贴壁细胞总蛋白的提取
（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0．01mol／L pH 7．2～7．3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗渣。重复以上操作两次，共洗细胞3次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10ul PMSF（100mmol／L），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合）。
（4）每瓶细胞加400ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1．5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行）。
（6）于4℃下12000r／min离心5min。（提前开离心机预冷）
（7）将离心后的上清分装转移倒0．5min的离心管中放于－20℃保存。
2．组织中总蛋白的提取
（1）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
（2）加400ul单去污剂裂解液（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
（3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
