基因工程操作能够跨越天然物种屏障，把来自任何生物的基因插入到新的宿主细胞中并扩增。在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先并无该类分子的细胞内并持续稳定增殖和表达。基因工程的所有操作，基本上都依赖于核酸的操作技术，也就是常说的基因操作的相关实验技术。
4.1核酸的提取与纯化
核酸在细胞中的含量很少，如核DNA，每个细胞中只有10－15～10－10g。不同物种细胞核中DNA的平均含量变动很大，但同一物种不同个体及个体的不同组织，其细胞核中DNA的含量是恒定的。RNA分子较小，相对分子质量约为2.5× 104～2× 106。DNA分子很大，相对分子质量约为106～1011。真核生物的DNA主要存在于细胞核中，只有约5%存在于线粒体、叶绿体等细胞器中，真核生物的RNA则75%左右存在于细胞质中，约15%存在于细胞器中，约10%存在于细胞核中。原核生物的DNA集中在核质区。RNA分散在细胞质里，细胞质中的RNA中，以rRNA的数量最多，tRNA其次，mRNA最少。真核生物的染色体DNA是双链线状，细胞器DNA、原核生物“染色体”DNA、质粒DNA是双链环状的。多数生物体的RNA分子是单链线状的。病毒、类病毒所含的DNA和RNA形式多样。
基因工程的主要操作对象就是核酸，所提取的核酸质量好坏就直接关系到实验的成败。
通常，细胞内的DNA包括基因组DNA和质粒DNA两大类。基因组DNA的提取一般依据实验材料来选择合适的方法，相对较为简单；而质粒DNA通常作为载体来进行转化，关系到转化的效率，所以显得尤为重要。
基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交、限制性核酸多态性（RFLP）分析以及运用PCR技术分离目的基因等。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其挑出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取DNA的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，尽量减少酚氯仿抽提，混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA片段，如利用甲酰胺火棉胶袋法，可以得到200kb 以上的DNA片段。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb 以上，否则酶切后很少有带合适末端的有效片段。而进行RFLP 和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP 片段（20kb 以下），并保证含有PCR扩增所需要的片段（一般2kb 以下）。
不同生物（植物、动物和微生物）基因组DNA的提取方法有所不同；不同种类或同一种类的不同组织其细胞结构及所含的组分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照相关文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
质粒DNA的分离方法很多，其依据是利用分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常用的有碱变性抽提法、煮沸法、去污剂（如SDS）裂解法、羟基磷酸灰石柱层析法、质粒DNA释放法、酸酚法等。碱变性抽提法和煮沸法反应比较剧烈，均可破坏碱基配对，使宿主细胞的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA由于拓扑缠绕，两条链不会互相分离。当外界条件恢复正常时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，而较大的线性染色体DNA则难以复性，这两种方法适用于较小的质粒。去污剂裂解法的条件则比较温和，一般用来分离大质粒（ ＞ 15kb）。以上方法均有利弊，有的难以控制，有的得率不高，有的手续繁琐，还有的纯度不高，因此在制备质粒时，不但要考虑该质粒的特性，还要考虑提取的质粒DNA的用量与用途，最终选择最佳的实验方法。
有时所得的DNA纯度不符合进一步操作的需要，还需要进一步纯化。质粒DNA纯化的方法都是利用质粒DNA相对较小和它的共价闭合环状特性。常用的纯化方法有CsCl 溴化乙锭梯度平衡离心和PEG 差别沉淀。前者可完全分离闭合环状DNA分子，适用于纯化易于产生切口的较大的质粒（ ＞ 15kb）。后者省钱省时，但不能有效地将质粒DNA的切口环状分子与闭合环状分子分开。然而，这两种纯化方法都可得到足以胜任分子克隆中各种复杂工作的质粒DNA。许多厂家根据离子交换、凝胶过滤等方法的原理设计了各种商品层析柱，也可快速分离纯化微量的质粒DNA。基因组DNA可用oligo（dT)纤维素、Polyu 琼脂糖柱层析、超离心、分子杂交、电泳等方法纯化。
4.1.1核酸提取与纯化的基本原理
DNA是基因的物质载体，是基因操作的重点对象。在实际操作中主要涉及两类DNA，其一是目的物种或细胞的基因组DNA，其二是克隆载体和装载在载体中的克隆化基因。
在进行DNA抽提之前，需进行细胞破碎。细菌细胞有坚硬的细胞壁，因此必须除去细胞壁才能把细胞内容物释放出来。细胞壁除去的方法有：①机械法，如超声波、研磨法或匀浆法。②化学试剂处理，即用EDTA 和去离子剂SDS（十二烷基磺酸钠）处理，EDTA 能螯合二价离子，因而使细菌外膜不稳定，从而抑制了DNase 的活性，保护DNA不被降解，而去离子剂则具有溶解膜脂的作用。③酶解法，加入溶酶使细胞壁破碎。植物细胞也有细胞壁，但结构与细菌不同，因此需要采用不同的方法处理，一般采用机械法或酶解法处理。动物细胞没有细胞壁，因此只用温和的去离子剂溶解细胞膜即可。
破碎的细胞或组织，去除了细胞壁或细胞质膜所得到的混合物中包括DNA、RNA与蛋白质、脂肪和碳水化合物。由于细胞突然被裂解，会导致部分染色体断裂，特别是细菌染色体在自然状态下应该是环形的，此时会有部分开环，变成线形。因此，如果要获得大片段染色体DNA，温和的裂解条件是很重要的。
破碎细胞后，需采用不同的方法分离DNA、RNA或蛋白质，以获得高纯度的核酸。①去除DNA中的RNA。用RNase 消化即可去除DNA中的RNA。RNase 是一种热稳定酶，能够除去痕量的DNase，否则DNase 会降解DNA。RNase 在使用之前要加热。②去除RNA中的DNA。去除RNA中的DNA要复杂得多，因为需要无RNase 活性的DNase。不过现在有商品化的无RNase 活性的DNase，也有无DNase 活性的RNase。③去除蛋白质。核蛋白常用蛋白水解酶消化，如蛋白酶K ；也可用高浓度的氯化钠溶液，在高盐溶液中，核蛋白易解聚，游离出DNA。
去除蛋白质是核酸提取至关重要的一步。由于细胞中含有大量降解核酸的酶，某些蛋白会结合核酸从而干扰核酸提取过程。常见的去除蛋白质的方法是酚氯仿法（酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1），酚和氯仿皆不溶于水。苯酚作为蛋白质的变性剂，可以抑制DNase的降解作用。当用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白质与DNA的联结作用已被蛋白酶K 打断，蛋白质分子表面又含有许多极性基团，与苯酚相似相容，所以蛋白质分子溶于酚相，而DNA溶于水相。因此，当酚和氯仿加到细胞提取液中分层，提取液经充分混合后，蛋白质会变性并沉积于中间层。
酚和氯仿都有变性蛋白质的作用，但酚的变性作用要大于氯仿。水饱和酚的比重略大于水，在高浓度的盐溶液中，会有部分酚跑到水相中，这不利于DNA的回收。加入氯仿后增加比重，使酚氯仿始终在下层，方便水相的回收。此外，酚和水有一定程度的互溶性，如果单独用酚抽提会有大量的酚溶到水相中，抑制后续的PCR操作。可以通过多次酚氯仿抽提来保证除去痕量的酚。酚是剧毒物质，操作时务必戴手套。而异戊醇的作用仅仅是为了在离心时起消泡的作用，使水相与有机相更加清晰，以便于水相的回收。
经过酚氯仿处理的匀浆液会分成三层，上层为水相，蛋白质位于中间层，下层为有机相。
经过酚氯仿抽提后，蛋白质被去除。但提取液中的核酸浓度很低，而且还含有少量酚氯仿（酚可以部分溶解于水），会导致以后步骤（如PCR）中酶变性。最好的方法是沉淀核酸，如加入酒精或异丙醇。当存在一价阳离子（Na＋，K＋，NH＋4）时，核酸被沉淀的同时，一些盐也会被沉淀下来，可以用70%的酒精除去沉淀中的盐。
在抽提动物细胞核DNA时存在两个困难（高等植物与此类似）：①从处死动物、分离组织器官到破碎细胞费时长，在此期间DNA可能会被DNase 降解；动物组织，特别是肌肉组织很难破碎，即使是较易破碎的肝、肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA断裂。②动物细胞核的DNA相对分子质量大，一般比细菌的大2～3个数量级，比病毒的大4～5个数量。因此对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。
4.1.2植物细胞核DNA的提取
植物细胞DNA包括细胞核DNA、线粒体DNA与叶绿体DNA。对于基因组文库的构建，常常需要高质量的细胞核DNA，为了保证文库的插入片段大、基因组覆盖率高，抽提时常采取一些特殊的处理；而对于普通用途的细胞核DNA的抽提相对简单。由于细胞壁及植物特有的细胞内物质，从植物中分离高产量和高质量的DNA并不是一件容易的事，因此需要用与动物及微生物不同的方法抽提。下面以水稻为例分别介绍这两种用途的细胞核DNA的提取。
1.基因组文库构建所需细胞核DNA的抽提
取幼苗约30g，用液氮研磨成粉末后置于烧杯中，加入200mL 预冷的抽提缓冲液（10mmol／L Tris·HCl pH9.5，10mmol／L EDTA pH8.0，100mmol／L KCl，500mmol／L蔗糖，4mmol／L亚精胺，1mmol／L精胺，0.1%β巯基乙醇），冰浴下充分匀浆，依次用150、200、400目的尼龙筛网过滤并不断搅拌。在滤液中加入100mL 含20%Triton X100的抽提缓冲液，冰浴搅拌，按每管50mL分别装入离心管中，4℃1500g离心10min，收集细胞核，用抽提缓冲液洗涤一遍。用1mL吸管头将核悬浮并拌匀，45℃水浴中保温2min，加入1／2体积的1.5%低熔点琼脂糖，拌匀后注入凝胶片模板并放于4℃冰箱促进凝固，制备好的琼脂糖凝胶块用5倍体积裂解液（0.45mol／L EDTA，1%Sarkosyl，0.25mg／mL蛋白酶K）50℃轻轻摇动洗涤，50℃保温1～2天，用TE 洗凝胶片3次，每次20min。再用含1mmol／L PMSF（phenylmethylsulfonl fluoride，溶于异丙醇中）的TE 在50℃保温1h。通过上述处理后，琼脂糖凝胶块中包含制备好的超大片段基因组DNA。
高相对分子质量基因组DNA的制备是构建基因组文库的一大难关，关键是控制好细胞核包埋在琼脂糖凝胶块中的质量，包括细胞核的质量和浓度、琼脂糖凝胶的浓度等。若细胞核在包埋之前破裂、细胞核浓度太低、琼脂糖浓度过高等，都会造成失败。为了防止细胞核的破裂，用于建库的组织始终在液氮中研磨且不能研磨得过细，做细胞核悬浮时动作必须轻柔。包埋的琼脂糖浓度过高会影响酶切效果，甚至造成无法酶切。研磨时液氮充分，大片段的操作除酶切外全部在4℃以下进行，这样就有效防止了DNA的物理损伤和降解。选用绿色嫩叶为原材料，对粗提的细胞核进行洗涤时，可以减少叶绿体的污染情况，纯净的细胞核是浅黄色的，若颜色偏绿，可通过增加洗涤次数和降低离心速度来减少叶绿体的污染。若在进行脉冲电泳分离后切下的片段太大，则连接效率就太低，故切下大小为100～300kb 的片段，连接效率高，产生的白色菌落多，蓝色菌落很少。
