在双子叶植物中，TGMV的衣壳蛋白基因被Npt Ⅱ和Cat取代，并得到复制和表达，进一步说明GeNV是一种很有前景的转化载体。
烟草脆裂病毒（TRV）是一种单链RNA病毒，TRV基因组由两段独立的RNA组成，每一段都包装成棒状的病毒颗粒。其中较长的一段RNA因为不含有衣壳蛋白的编码序列，所以单独存在时只能产生不包装RNA分子。较短的RNA编码衣壳蛋白，但其复制必须有较长RNA的存在才能进行。利用这两种病毒颗粒共同感染植物，可以使病毒基因组得到正常的复制和表达。一般认为，利用RNA病毒作为转化载体首先单链的病毒RNA在反转录酶的作用下反转录成一条单链的CDNA，然后单链CDNA在DNA聚合酶的作用下形成双链CDNA，通过重组技术CDNA双链插入到克隆质粒中，使在克隆质粒中的病毒CDNA连同外源基因先转录成RNA转录体，再用此来感染植物。
3.8动物基因工程载体
将外源基因转入动物细胞，通常应用由动物病毒构建的一类载体。病毒具备异常有效的入侵细胞的能力，因此它是功能强大的基因转移载体。例如SV40病毒载体、杆状病毒载体在动物基因工程中已愈来愈普遍地应用。但是在构建病毒载体时，因为病毒本身的致病性，所以往往利用致病力弱的动物病毒或某些病毒的弱毒株进行改造，构建成基因载体。
动物病毒侵入动物细胞后，呈现裂解感染和整合性感染两种生长状态。裂解感染是依靠宿主细胞的酶和调控系统合成病毒核酸和结构蛋白，病毒DNA大量复制，在感染的细胞内有着大量的病毒DNA拷贝，病毒在细胞内装配成完整的子代病毒颗粒，释放到细胞外，扩大感染，感染细胞则大多数因代谢障碍而死亡。整合性感染是病毒核酸整合到细胞染色体中，随着细胞DNA的复制而扩增。病毒DNA的序列中往往具有几个很强的启动子，它可使排列在其后方的基因高效表达。如果将外源基因插入在病毒DNA强启动子的后方，那么随病毒DNA在细胞内大量复制的同时，也将得到外源基因的高效表达。
3.8.1SV40病毒载体
SV40是一种猿猴空泡病毒，环状双链DNA分子，全长5241bp。根据基因组内转录的时间顺序和方向，分为两个转录区域，即早期转录区和晚期转录区。当它感染猿猴细胞时，其DNA进入细胞核后，开始依次进行早期转录、DNA复制、晚期转录。在早期转录中产生T抗原和t抗原。当细胞内T抗原和t抗原积累到足够时，T抗原启动DNA复制，并启动顺时针方向的转录。在晚期转录中，产生病毒外壳蛋白VP1、VP2、VP3，并与新复制的病毒DNA装配成病毒颗粒，细胞内病毒颗粒达到105个时，细胞破裂，释放出病毒颗粒。此过程称为裂解感染，这种敏感细胞称为受纳细胞。当SV40感染啮齿动物细胞（如仓鼠、小鼠细胞）时，DNA整合到宿主细胞的染色体DNA上，随染色体DNA复制而复制，不会使细胞破裂，最终导致细胞癌变，不产生病毒颗粒，这个过程称为非裂解感染，这类细胞是非受纳细胞。SV40致瘤的原因主要是其基因组整合入宿主基因组，可以整合病毒基因组的某些片段，也可以整合10拷贝以上的病毒基因组；但至今人们对整合机制还不清楚。
SV40病毒基因组中，早期区域和晚期区域是相对独立的转录单元，因此可以有晚期区被取代和早期区被取代两种类型的取代型载体。SV40颗粒包装对分子大小有严格限制，构建载体只能是取代型的，被取代的DNA不能超过基因组全长的30%。
对于晚期区取代型载体，由于缺失晚期区域，不能将重组DNA包装成新的病毒颗粒，因此这样的克隆载体必须与辅助病毒一起感染受体细胞。辅助病毒是一种不产生T 抗原，但能产生外壳蛋白的突变体。在受体细胞内，依赖辅助病毒产生的外壳蛋白，重组DNA包装进新的病毒颗粒。
对于早期转录区取代型载体，由于缺失早期区域，不能产生T 抗原，缺失复制功能，必须具有T 抗原互补功能的辅助病毒，或者建立含SV40早期转录区的辅助细胞系（如COS、HFS细胞系）。一般用后者把SV40早期转录区DNA序列整合到敏感动物细胞基因组中，使其有效表达T 抗原。当早期区DNA序列被外源DNA取代的重组SV40DNA导入这种细胞时，T抗原得到互补，重组SV40DNA能进行有效复制。
3.8.2反转录病毒载体
反转录病毒又称逆转录病毒，是一类RNA病毒。该类病毒大多数具有致瘤性，故又称为RNA肿瘤病毒。其基因组RNA进入宿主细胞后通过自身编码的反转录酶合成双链DNA，这种DNA能随机整合到宿主细胞基因组中，随宿主细胞基因组一起复制或转录，转录产生的正链RNA可以装配成病毒颗粒，也可以不发生装配，成为病毒蛋白合成的模板。
反转录病毒的基因组为两条相同的单链RNA组成的二聚体，通常长为8～10kb，其两端含有相同的结构，即长末端重复序列（long terminal repeat，LTR），其长度为几百个碱基。逆转录病毒能在宿主细胞中永久性地表达外源基因，具有构建载体的良好特性。此外，它能感染几乎所有类型的细胞，受体细胞的范围广泛。
反转录病毒载体的类型，早期构建的多为单基因载体，是以单个外源基因取代反转录病毒的反式作用序列。由于这种载体的外源基因表达只受LTR 中病毒的唯一启动子调控，因而应用受到局限。后来构建的并被广泛应用的是多基因载体，例如双表达载体、自灭活载体、自分解载体等。双表达载体保留了大部分的病毒顺式作用序列。病毒载体携带2个外源基因，均处于5′端LTR 中启动子的控制下，这种载体的特点是提供了病毒基因转移、表达的顺式作用序列，即5′端LTR 中的启动子、增强子、3′端LTR 中的多聚A 信号和内含子剪切位点。但是转移的基因只在病毒启动子有活性的细胞中才能表达。自灭活载体通过缺失LTR中的部分启动子和增强子，产生的自灭活载体在感染宿主细胞后形成的前病毒DNA不能进行转录，外源基因由自身融合的启动子控制表达，因而不会发生插入激活作用。此类载体的特点是比较安全，但不足之处是大多数载体产生病毒感染的滴度较低，不能进行有效的基因转移。自分解载体含有反转录病毒的内部附着序列，病毒基因组的结构不完整，病毒复制两次后前病毒DNA整合到宿主基因组中，外源基因的内部启动子控制进行特异的表达。此种载体不能产生复制性病毒粒子，因而也是一种安全的反转录病毒载体。
以反转录病毒作载体进行基因转移具有基因转移效率高、病毒感染力强等优点，而且反转录病毒有广泛的宿主范围，不仅适用于单层细胞，也适用于悬浮培养的淋巴细胞、前髓细胞及造血干细胞等多种骨髓来源的细胞；经特殊构建的反转录病毒载体是缺陷型，不易产生感染性病毒粒子，比较安全。不过，有的反转录病毒载体可能具有潜在激活癌基因的作用。
3.8.3痘苗病毒载体
痘苗病毒的基因组是一个线性双链DNA，长约185kb，其中有一个28kb 的区域是病毒复制的非必需区，可以被外源基因取代。痘苗病毒能在宿主的细胞质中独立地复制和转录，高度稳定，宿主范围广，因此，可以作为良好的载体。痘苗病毒载体的构建需要采用同源重组的方法。重组痘苗病毒表达外源基因，需要在基因两端组装上胸腺嘧啶核苷激酶的tk 基因或ha基因同源重组，将外源基因整合到痘苗病毒基因组上。痘苗病毒载体通常具有三个主要成分：痘苗病毒的调控序列、胸腺嘧啶核苷激酶基因（tk 基因）以及位于tk 基因中供外源基因插入的克隆位点，利用tk 基因插入失活作为选择标记。
痘苗病毒载体的主要用途是构建痘苗病毒活疫苗。迄今为止，用痘苗病毒载体表达的外源基因有：乙型肝炎表面抗原基因、流感病毒血凝素基因、狂犬病毒表面糖蛋白基因，以及单纯疱疹病毒、EB 病毒、水泡性口炎病毒、伪狂犬病毒和疟原虫等的抗原基因。
3.8.4腺病毒载体
腺病毒是一种二十面体的颗粒线状双链DNA病毒，其基因组大小为32～36kb，分为哺乳动物和禽类两个属。在线性DNA两端各存在1个含103～162bp 的反向末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR），因此变性后的两条链可能分开成单链，彼此形成一个茎环结构。ITR为病毒DNA复制的起始位点。
野生型腺病毒容纳外源DNA的最大容量为2kb。如果将病毒的非必要区域删去，用外源DNA取代，可以增加病毒接受外源DNA的容量，又不影响重组病毒的复制和包装。理论上，基因组除了两端各约500bp 的序列结构是复制和包装所必需的，其他部分均可以被外源DNA取代。人腺病毒具有易感染性，宿主范围广，而且外源DNA不会整合到宿主染色体上，具有较高的安全性，已成为较有前途的基因转移载体之一。
腺病毒载体在转移和表达外源基因方面具有许多优点：①其基因组较小，易于操作；②有多个外源基因插入位点；③腺病毒DNA不整合到宿主染色体上，不会引起插入突变；④腺病毒致病性小，重组腺病毒结构稳定；⑤重组病毒滴度高。
本章小结
基因工程载体是指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，它的本质是DNA复制子。作为基因工程载体必须具备3个基本条件：①能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制。②具有合适的限制性核酸内切酶位点。③具有合适的选择标记基因。使用最多的基因工程载体是质粒载体和噬菌体载体。
质粒载体主要有克隆质粒载体、表达质粒载体、穿梭质粒载体等。常用的克隆质粒载体是pBR322及pUC 系列。噬菌体载体主要有λ噬菌体载体和M13噬菌体载体。它们的克隆容量大于质粒载体，用于基因文库的构建。插入型λ噬菌体载体的克隆容量小于取代型λ噬菌体载体，前者只能克隆10kb 以下的外源DNA片段，后者可克隆20kb 左右的外源DNA片段。M13噬菌体载体在制备单链DNA中有重要用途。黏粒载体是一类含有λ噬菌体的cos 序列的质粒载体，它的克隆容量较大，一般为35～45kb，主要用于真核基因文库的构建。但上述载体的克隆容量有限，不能满足基因组计划的大片段DNA的克隆，因此，构建了一系列的人工染色体。YAC 的克隆容量为100～2000kb。BAC 的克隆容量可达300kb。利用植物病毒构建了病毒转化载体，但转移的外源基因不能整合到植物基因组上，以游离拷贝的形式存在。动物基因工程载体主要来自于动物病毒，用于基因高效表达和基因治疗的研究。相对于植物病毒转化载体来说，动物病毒载体大多数都能将外源基因整合到宿主基因组上，随宿主染色体的复制而遗传给后代，主要有SV40病毒载体、反转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺病毒载体等。
思考题
1.构建基因工程载体的基本原则是什么？
2.构建λ噬菌体载体的主要内容是什么？
3.M13噬菌体载体的主要用途是什么？
4.黏粒载体具有哪些优缺点？
（邹克琴）
