（三）凋亡检测观察
凋亡细胞核经碱性磷酸酶底物反应液为黑色，经过氧化物酶DAB 反应为棕黄色。
四、细胞染色体制备和应用相关技术
细胞染色体检测属于经典的细胞遗传学领域，用于染色体分析的标本包括外周血、脐血、羊水和绒毛及肿瘤组织，其中常规方法是体外培养外周血淋巴细胞，在植物凝集素（PHA）刺激下转换为有丝分裂的淋巴母细胞，经纺锤体抑制剂秋水仙素作用，使之分裂停滞于分裂中期，从而获得该期染色体标本。
（一）器材、方法和操作
1.器材超净工作台、恒温箱、离心机、天平、PRMI1640培养基、小牛血清、培养瓶、弯头吸管、刻度离心管、酒精灯。
2.方法
培养液配置：
PRMI1640培养基80％
混合小牛血清20％青霉素100U／ml 植物凝集素（PHA）1mg／5ml 链霉素100U／ml 3.操作程序（1）抽血3ml（空针含0.1～0.2ml肝素）。
（2）用7号针头向每培养瓶（内装5ml培养液）滴血15～16滴，摇匀，37℃培养箱培养72小时。
（3）终止培养前3小时，用7号针头向培养瓶中加秋水仙素3滴（20μg／ml）并混匀。
（4）制片
①吸取培养物于离心管内，1500～2000rpm 离心10分钟，弃上清，取沉淀细胞。
②离心管内加入预温（37℃）KCl（0.075mol／L）8ml，充分吹打，分散后，置离心管于37℃水浴，20～30分钟；③离心管内加新配置的甲醇－冰醋酸（3∶1）固定液1～2分钟，混匀，离心2500rpm10分钟，去上清，留沉淀。再加入上述固定液8ml，轻混匀后，净置30分钟以上。同样离心10分钟，然后再重复固定、离心一次。
④弃上清，吸管吹打沉淀物，再加入6～7滴固定液，混匀后，把沉淀物滴加预冷的玻片上，放入4℃冰箱内置蒸馏水的瓷盘晾干标本后，置于75℃烤箱2.5小时，自然冷却。也可将标本吹干后，火焰烘干。
⑤用Gimsa染液（pH 7.4磷酸缓冲液1∶10配制）染玻片10分钟，自来水冲净，晾干。
⑥显微镜下选择染色体分散好、无胞质背景、处于中期分裂的培养细胞，在高倍油镜下观察染色体形态计数、分组（A～G 组）和性别鉴定Х、Y 染色体，拍照对比，存档。可进一步根据需要，进行染色体Q 显带、G 显带、C 显带、R 显带和T 显带。
4.注意
（1）PHA 是体外细胞培养的关键因素，浓度需根据批号调整。
（2）秋水仙素的浓度及作用时间影响标本分析，作用不足分裂细胞太少，作用过度则染色体缩短不利观察。
（3）肝素过多可能抑制淋巴细胞母化。
（4）显带检测以存放3天的标本为好，观察G 显带，检材要用胰酶液消化，消化液的配制和条件需摸索才能获得最佳结果。
（二）染色体相关应用技术
1.荧光原位杂交技术（FISH）
荧光染色体原位杂交是以荧光素标记已知序列的核苷酸探针，以荧光显微镜观察荧光杂交信号来定性和定位目的核苷酸片段，快速敏感地显示中期核分裂像及间期核DNA。
（1）试剂、仪器：10×缓冲液、0.5mg／ml 牛血清蛋白、0.1mol／Lβ－琉基乙醇、10×核苷酸混合液、DnaseⅠ溶液、过柱缓冲液、制备过滤、50×Denhardt′s液、预杂交液、漂洗缓冲液、封闭液、0.2％吐温液、抗体结合工作液、核固红、荧光显微镜等。
（2）荧光素-dUTP 标记探针的基本操作：回收探针片段100℃煮沸10分钟，冰浴速冷，依次加入3μg 变性cDNA，2μl六核苷酸引物，2μl荧光素-dUTP，加双蒸水至19μl，加入1μl Klenow酶，离心数秒，37℃温浴过夜，2μl0.2mol／L pH 8.0EDTA终止反应，2.5μl4mol／LLiCl和75μl预冷乙醇混合，－20℃过夜，12000rpm 离心15分钟，弃上清，70％冷乙醇洗后，真空抽干，50μlTE（pH8.0）溶解，－20℃保存备用。
（3）杂交基本操作
①取制备好的染色体玻片，三蒸水洗，0.2％DEPC 水室温浸泡10分钟，0.2mol／L HCl室温浸泡30分钟。
②探针和试剂盒操作：根据市售的不同类型商品化探针操作说明进行实验，如avidin－FITC、anti－avidin和PI等试剂盒类型。
③杂交前变性探针和标本：煮沸10分钟，－20℃冰浴3分钟，滴加杂交，加盖玻片，100℃变性10分钟，－20℃冰浴5分钟，置玻片于湿盒37℃24～36小时。市售商品试剂盒按操作说明杂交。
④梯度SSC 液漂洗，蒸馏水冲洗，乙醇脱水，晾干，划圈，血清封闭，地高辛抗体（1∶500）反应切片，室温下湿盒2～3小时，BufferⅠ和Ⅱ漂洗，NBT＋BCIP 避光反应，核固红衬染，常规脱蜡至水，透明，封片。
以上杂交和变性过程，如应用试剂盒也须按商品化试剂操作路线进行。
（4）检测：杂交后的标本除去封胶，2×SSC 洗去盖片，经多步骤漂洗后，依次在亲和素－荧光素、抗亲和素抗体和亲和素－荧光素中，各孵育20分钟（生物素标记探针），其间及其后各用1×PBD 洗3次，每次2分钟。若直接法FISH 进行检测，后继免疫结合反应可省略，最后应加入抗荧光衰变剂（盐酸亚苯基二胺）和DNA 复染剂（碘化丙啶）后封片。
（5）荧光显微镜观察，并摄影保存，染色体目的核苷酸杂交信号为黄、绿色，染色体和间期核为红色，背景无任何荧光。
2.比较基因组杂交（CGH）CGH 是将消减杂交和FISH 技术相结合，主要用于肿瘤细胞遗传学研究，检测基因小范围的缺失和扩增，并且在染色体上将这些改变进行定位。基本原理是将肿瘤基因组DNA 和正常基因组分别用不同颜色的荧光染料（红、绿色）标记，与正常中期染色体原位杂交，荧光分带染色，检查正常中期染色体各个座位上两种荧光强度比，判断肿瘤细胞基因不同序列的拷贝数变化（增加或缺失）。
（1）试剂、仪器和染色体制备基本同前。
（2）DNA 的提取和标记按试剂盒操作说明进行。
（3）以被标记的DNA 探针与正常中期染色体进行原位杂交。
（4）荧光显微镜检查、数字化图像显示各染色体纵轴产生的绿、红荧光密度比率，分析各对应区域的拷贝数变化。
（5）检查结果除分析肿瘤基因组热点拷贝数目的异常外，也可分析编码基因及其与肿瘤的发生、发展、诊断、分类和预后因素。
（6）注意
①一次性制备大量正常中期染色体标本片，以保证实验使用同一批样本。
②高质量的中期染色体制备及DNA 提取、标记、染色和图像分析，对CGH 更为重要。
③CGH 检测3～5Mb 的最小增加量或最小缺失量，可能会漏检小片段拷贝数的变化，且不能检出染色体平衡结构重排和多倍体异常。
五、DNA 测序
DNA 测序又称基因测序，它是进行基因结构和功能研究不可缺少的步骤，也是分子生物学技术标准化最高、重复性最好的技术，目前已完成人类全部3亿个碱基对、4万个基因组序列的检测，基因组学因此进入了后基因组病理分子诊断应用时代。
（一）试剂、仪器
1.DNA 模板或cDNA 模板。
2.纯化的PCR 产物、质粒。
3.测序反应体系。
DNA1μl引物（3.2pmol／μl）1μl
BigDye4μl去离子水4μl
4.测序产物纯化试剂：乙醇／EDTA／NaAc。
5.靶基因引物或再测序试剂盒。
6.毛细管测序仪（ABI）及SeqAnalysis、SeqScap 自动测序分析、比对软件，也可用平板或其他基因测序仪。
（二）基本操作
1.获取优质DNA 模板，不同bp 检测长度要求不同的模板量。或采用质粒。
2.测序前PCR 扩增，电泳检查DNA 浓度、质量。
3.PCR 产物纯化，有杂带时需割胶。
4.测序PCR 反应。
5.纯化测序产物。
6.配制电泳样品，变性。
7.上测序仪检测并分析数据，比对结果。
8.配合病理标本诊断，给出客观性报告。
（三）注意事项
1.PCR 产物是测序的关键，其中引物与模板的平衡最重要。
2.引物的设计、合成极为重要，推荐自动检测标准化的商品化再测序试剂盒。
3.测序产物的纯化对测序质量很关键。
4.严格控制PCR 交叉污染，建立分区使用的试验室。
5.培训合格的测序人员上岗。
