（二）获取DNA 模板
1.待检组织
（1）石蜡包埋组织：用中性甲醛溶液固定的组织，10～20μm厚切片，4～8片，置1.5ml离心管，二甲苯多次脱蜡，梯度乙醇洗涤，干燥。
（2）新鲜组织或冷冻切片：将50～100mg组织机械剪碎。
（3）体液、血液标本：参照有关分子生物学技术手册。
2.以上组织加入500μl消化缓冲液中，54℃下过夜。
消化缓冲液：Tris－HCl（pH8.0）500mmol／L
NaCl10mmol／L
EDTA10mmol／L
SDS1％
蛋白酶K200mg／ml
3.先以酚－氯仿－异戊醇（25∶24∶1）抽提一次，再以等体积氯仿－异戊醇（24∶1）抽提一次。
也可选用市售的各类DNA 抽提试剂盒，按其说明书操作。
4.取管中上清水相，加1／10体积NaAc（2mol／L，pH7.4）和2.5倍体积冰乙醇沉淀DNA，过夜，4000rpm 离心15分钟，弃上清，取沉淀溶于25μlTE 缓冲液中，－20℃保存。
TE 缓冲液
Tris－HCl 10mmol／LEDTA（pH8.0）1mmol／L（三）基本操作1.建立PCR 反应体系（表82）表82PCR 反应体系成分加样量终浓度10×缓冲液5μl1×dNTP 混合液1μl每种0.2mmol／L TaqDNA聚合酶（5μ／μl）0.25μl0.025μ／μlMgCl2（25mmol／L）3μl1.5mmol／L（续表）成分加样量终浓度10×缓冲液去离子水引物5μl加至50μl上游与下游各50pmol／L1×1μmol／L模板DNA1μmol／L说明：
①总体积为50μl。
②引物的计算：50pmol／L＝16.3ng×b（b＝引物碱基数）。
③模板DNA 量：最好＞104拷贝。
④用于逆转录PCR（RT－PCR）的cDNA 模板，可通过RNA 逆转录获得，如同时多标本扩增，可预先将前5种成分混合。
2.先将PCR 工作液加入0.5ml的薄壁Eppendorf离心管内，然后加入模板和引物。
3.混匀，稍离心。
4.在反应液表面涂抹20～40μl矿物油。
5.反应管在PCR 仪上进行反应
常规PCR 反应循环参数为：
（1）95℃变性2分钟。
（2）此后每循环周期为：①变性：94℃，60秒。②退火：
55℃，40秒。③延伸：72℃，60秒。
（3）一般设30～35个循环，具体视实验项目而定。
6.由PCR技术衍生和发展了多项PCR相关技术（参照专业资料）。
（四）PCR 反应产物鉴定
取5μlPCR 反应产物做琼脂糖凝胶电泳，EB 染色后在紫外灯下观察或在凝胶电泳显影装置上观察：正常反应产物结果，应为预计分子量的大小的位置出现清晰的单一条带。
反应产物在－20℃下贮存，或经纯化后用于其他实验。
（五）严防交叉污染
1.严格区分不同的工作区域，一般分标本处理和DNA 提取区、溶液配置电泳区、PCR 扩增区。特别在高敏、扩增和气溶胶环境反应时，应在独立房间和超净工作台内进行。
2.操作时必须戴手套，最好戴口罩和帽子。
3.尽量使用一次性移液枪头和试管。
4.试剂、缓冲液和双蒸水预先配置并分装，每次用一份，避免重复使用。
5.有关溶液和用具需经高压消毒或紫外线照射消毒，实验用房间应定期紫外线照射消毒。
6.每次扩增实验均应同时设定阳性对照和阴性对照。三、使用PCR 技术检测基因重排（一）概述基因重排是指免疫系统Ig 和TCR 分子的基因重排事件，通过PCR 反应来诊断淋巴造血组织细胞疾病的基因结构和功能改变。
（二）试剂、方法
1DNA 提取石蜡包埋组织，新鲜组织，骨髓和外周血，棉拭子细胞，按上述方法或按操作说明书进行。
2反应体系配置先在0.5ml离心管中依次加入水、10×Buffer、MgCl2、dNTP、引物1、引物2、DNA 模板，混匀离心后滴加2滴液体石蜡，置于PCR 循环仪中，按照PCR 相应的文档程序94℃加热5分钟。当Time0：20时，按Stop 键暂停，每管加入2Taq酶后，按Start键继续扩增。
3.基因重排的基本操作基因重排的扩增包括两步，首先是IgH 的第一次扩增及TCR（基因扩增，再取IgH 的第一次扩增产物为模板，进行第二次扩增。
（1）IgH 的第一次扩增及TCR 扩增灭菌三蒸水10.5μl10×Buffer2.5μlMgCl22.5μldNTP0.5μl IgH TCRγ引物1（20pmol／μl）1μl （FR3A）（Mix1）（Mix2）引物2（20pmol／μl）1μl （LJH）（Mix3）（Mix3）DNA 模板5μlTaq酶（5U／μl）2μl（1U）（注：用灭菌水稀释）（2）IgH 的第二次扩增灭菌三蒸水15μl MgCl22.5μl 10×Buffer 2.5μl dNTP 0.5μl 引物1（20pmol／μl）1μl（FR3A）引物2（20pmol／μl）1μl（VLJH）DNA 模板0.5μl（IgH的第一次PCR扩增产物）Taq酶（5U／μl）2μl （1U）注：Taq 酶的稀释（5个反应管）：1μlTaq 酶原液＋9μl灭菌水。4.电泳检测（琼脂糖凝胶电泳）（1）试剂及其配制：琼脂糖、5×TBE、双蒸水、溴化乙锭液、DNA 上清缓冲液。
①5×TBE 缓冲液（储存液）：27g Tris＋13.75g 硼酸＋10ml0.5mol／LEDTA（pH8.0），溶于300ml双蒸水中，完全溶解后定容至500ml，室温保存。
②10mg／ml溴化乙锭液：100mgEB＋1ml双蒸水，避光，4℃保存。
③DNA 上清缓冲液（6×LoadingBuffer）：50mg 溴酚蓝，8g 蔗糖，加蒸馏水至20ml（4℃保存）④2％琼脂糖：2g琼脂糖＋100ml0.5xTBE，微波溶解3次。冷却至60℃时，加8μl10mg／ml溴化乙锭液，混匀。
（2）方法
①将凝胶托架两端用胶带封闭并水平放置在工作台上，放上梳子。
②加热溶解琼脂糖完全后，将凝胶注入托架胶板上，使凝胶厚度为5～7mm。排除气泡，待凝胶完全凝固后，撤去两端胶带。
③将托架放入电泳槽中，加入0.5×TBE 电泳缓冲液，使之没过胶面2mm，拔出梳子。
④将PCR 反应产物6μl与DNA 上样缓冲液（6×Loading Buffer）1.5μl混合，用微量加样器将混合物加入凝胶样品孔中。注意不要溢出孔外。
⑤盖上电泳槽，接通电源。样品端接负极（电泳中DNA 向正极移动）。使用80～100V 电压电泳约30分钟。待溴酚蓝降至恰当位置（约移动4cm），小心取出凝胶，紫外光下观察结果。
三、原位凋亡杂交（TUNEL）技术
原位细胞凋亡杂交是各种细胞机制启动内源性核酸内切酶使DNA 链断裂，暴露出3′－OH 末端转移酶（TdT），在DNA 多聚酶作用下，人工掺入生物素或地高辛标记的核苷酸，用卵白素或地高辛抗体携带的荧光素或辣根过氧化物酶显色，特异性地标记凋亡细胞核阳性。
（一）试剂、耗材
1.市售原位凋亡杂交试剂盒现有Roche 公司、Intergen 公司、Phoenix公司产品等。
2.标记组织细胞可用石蜡切片、细胞涂片、冰冻切片等。
3.基本试剂5×TdT 反应缓冲液、Biotin－16－dUTP、TdT 酶、卵白－荧光素缓冲液、洗涤用缓冲液。以上试剂配置见各专业技术手册。
（二）基本操作
原位凋亡杂交已有成熟的试剂盒操作说明。以经过FDA 认证的TUNEL 法为例：
1.石蜡切片脱蜡，梯度脱水。
2.蛋白酶K 孵育20分钟，21～37℃。
3.PBS漂洗2次，每次3分钟。
4.按操作说明书即时制备TUNEL 混合反应液。
5.制备无末端转移酶的对照标记溶液。
6.擦干组织周围，加50μlTUNEL 混合反应液。
7.阴性对照加对照标记液。
8.组织块盖膜（parafilm 膜）。
9.切片在湿盒内37℃恒温箱反应1小时。
10.PBS漂洗3次，每次3分钟。
11.擦干组织周围，加50μlAP 或POD 荧光抗体显色液，盖膜。
12.切片在湿盒37℃反应30分钟。
13.PBS漂洗3次。
14.加50～100μl底物反应液，室温（20℃）暗场反应10分钟。
15.PBS漂洗3次。
16.核固红（fast－Red）衬染2分钟，漂洗（注：可省略）。
17.封片（AP／甘油或POD／树脂）后镜检。
