亚历山大首先率领部队攻克了小亚细亚，消灭了驻守在那里为数不多的波斯部队；随后向叙利亚北部挺进，途中，波斯皇帝大流士御驾亲征，从亚洲腹地征调几十万大军出现在亚历山大的背后，切断马其顿军的供应线。亚历山大回身面对大流士的优势兵力，进行了伊苏斯战役。对伊苏斯会战中波斯方的兵力，古典历史学家的说法不一，阿里安的《亚历山大远征记》中的60万肯定是大大夸张了。不过波斯兵力占很大优势是没有问题的。但波斯军的素质不如马其顿军。此战几乎全歼波斯军，大流士皇帝落荒而逃。
为了巩固侧翼，亚历山大没有穷追，而是回身继续向南征服地中海沿岸港口，经过七个月的艰难围攻，攻克了腓尼基的岛屿城邦推罗城（在今黎巴嫩）。在围攻推罗期间，亚历山大收到波斯国王的一封书笺，提出为了达成和平协议，他愿把半个波斯帝国割让给亚历山大。亚历山大的将军帕曼纽认为这个建议很好，他说：“如果我是亚历山大，我就采纳这个建议”。亚历山大回答：“如果我是帕曼纽，我也许会采纳这个建议。”
攻克推罗之后，亚历山大继续南进。经过两个月的围攻，埃及一箭未发，自动投降。接着亚历山大在埃及停留一段时间，让军队稍有喘息之机，并建立今天埃及着名的港口城市亚历山大。在那里年仅24岁的亚历山大被誉为法老，称之为太阳神阿蒙之子。
经过在埃及的修整，随后他率军返回亚洲，北上向波斯腹地进发，和大流士作总的清算。在阿贝拉会战，又称高加米拉会战中，亚历山大的4万步兵和7千骑兵，面对大流士御驾亲征召集的波斯帝国各部族倾国之兵。普鲁塔克的古典着作《希腊罗马名人传》说波斯军100万，另一古历史学家阿里安则说是4万骑兵、100万步兵、200辆大镰刀战车、15头战象（早于汉尼拔对罗马的战争，在印度以外使用战象这是历史记载的第一次）。这些数字当然是大大夸张了的。真正的波斯军数字已经不可考，最保守的估计是20万步兵和4万5千骑兵。阿贝拉会战的结果是古老而庞大的波斯帝国一战崩溃，大流士逃出战场。
取得这场胜利之后，亚历山大率军进入巴比伦和波斯的两座都城：苏萨和波斯波利斯。亚历山大随后展开了他的长途奔袭，从波塞波利斯到埃克巴达那，然后再到拉伽，穿过里海门，经过长时间的急行军终于追上了敌人。波斯军为了防止国王大流士三世（并非大流士大帝）向亚历山大投降，大流士手下的军官把他们的国王暗杀了， 时年为公元前330年。但是亚历山大击败了大流士的继承人柏萨斯，并将他斩首，经过三年奋战，攻克了整个伊朗东部地区，并继续向中亚推进。
亚历山大进入了波斯帝国的东部行省，主要是巴克特里亚和索格地亚纳。在处死了当地的代表反叛的柏萨斯之后，却陷入了斯皮塔米尼斯领导的东部游击战中。斯皮塔米尼斯行踪诡秘，曾经率领一只游牧军队击败了亚历山大的一支别队，并且攻陷了亚历山大的一些堡垒。亚历山大了解到了事情的严重性，对其展开军事上的围捕，并且对当地的叛乱势力进行残酷的镇压。期间亚历山大还击败了西徐亚人的游牧骑兵，证明了弓骑兵的游牧战术对于他来说不是什么问题，西徐亚首领马上表示臣服。斯皮塔米尼斯与亚历山大周旋了一段时间后，终于被亚历山大指派埋伏在当地的部将科纳斯给完全的击溃，被当地人献出后被处死。
主要对手被消灭后亚历山大着手镇压各地的叛乱，在索格迪亚纳岩的战役中展现了他率领的部队的山地作战能力，俘虏了当地的贵族和反叛首领阿克雅提斯的家眷，并且一改其在此地区的残酷风格，接纳战俘，并且打算正式迎娶阿克雅提斯的女儿罗克珊娜。其父得知消息后，亲自上门投降，自此东方行省的战役彻底结束，前往印度的道路已经没有障碍。
这时已经征服了整个波斯，本可以返回家园，重新筹划他的新领土。但是他征服的欲望并没有得到满足，而是继续挥军进入印度。进军到印度河以东的海达佩斯河，和前来抗击的印度国王波拉斯夹河对峙，打了他四大会战的最后一战：海达斯佩斯会战，彻底击溃了波拉斯的军队。因为钦佩波拉斯的勇敢，也为了赢得当地人的拥护，亚历山大战后义释被俘的波拉斯，仍然让他作印度国王。尽管波拉斯的两个儿子和一个孙子在战场上阵亡，波拉斯本人此后仍然对亚历山大死心塌地地效忠。
此时亚历山大手下的军队已经厌战，亚历山大不得不停止远征，开始西归，途中他击败了不服从他的部落，还派人进行了一系列探险活动，包括查明印度河入海口，寻找波斯湾，并绘制海岸地形图，还想查清里海究竟是海还是湖，等等。
回波斯的第二年，亚历山大用了近一年的时间对他的帝国和军队进行改编，这是一次重大的改编。亚历山大从小就认为希腊民族代表了唯一真正的开化民族，而所有非希腊民族都是野蛮民族。这当然是在整个希腊世界流行的观点，甚至亚里士多德也有这种看法。尽管亚历山大已经彻底打败了波斯军队，但是他逐渐认识到波斯人根本就不是野蛮人，他们与希腊人一样具有智慧和才能，一样值得尊敬。因此他产生了融其帝国的两部分于一体的设想，由此创造了合二而一的希腊波斯民族共和王国，当然是他自己当最高统治者。据我们所知，他确实想让波斯人与希腊人和马其顿人结成同等的伙伴。为了实现这一计划，他把大量的波斯部队编入自己的部队，还为此举行了一次盛大的“东西方联合”宴会。在宴会上，几千名马其顿士兵同亚洲妇女正式结成夫妻。他自己虽然从前与一位亚洲公主结过婚，这次却娶个****利斯的女儿为妻。
显然亚历山大企图利用这支改编的军队再开展征服活动。我们知道他打算入侵阿拉伯，也许还有波斯帝国以北地区，也许打算再次入侵印度或征服罗马，迦太基和西地中海地区。不管他的算盘如何，结果进一步的征服活动都未能进行。公元前323年6月初，亚历山大在巴比伦突然因发热而病倒，十天后就死去了。其时还不满33岁。
长期以来其死因有不断的争议。大多数记载亚历山大在巴比伦的一次痛饮后，得了疟疾，除此之外伤寒也可能是另外一个凶手。还有理论认为他死于嚏根草中毒，密谋者可能包括他的妻子罗克珊娜，他的部将安提帕特以及他的老师亚里士多德。但是下毒的理论被如Robin Lane Fox质疑，因为在古希腊缺乏长作用时间的毒。
美国疾病控制和预防中心在最新出版的2004年7月号《新型传染疾病》杂志里刊登了几篇论文，讨论了“亚历山大死于西尼罗河病毒”说法。
亚历山大并未留下帝位的合法继承者，与他最亲近的是一位昏弱无能的异母兄弟。传说，当他的朋友在他临死前要求他指定一位继承人时，他含糊说：“让最强者继承。”于是他死后，他的将领们企图瓜分这个帝国，引发一些年轻军官对这种安排的不满，继而发生一连串的战争，在这场斗争中，亚历山大的母亲、妻于和孩子都横遭杀身之祸。
终于在公元前301年的一场决定性战役，由三位胜利者（即托勒密、塞琉古、安提柯一世（独眼的））瓜分了亚历山大帝国的版图，开启了希腊化时代。除了马其顿本土和最远的印度以外，亚洲部份由部将塞琉古继承，这就是后世和罗马的庞培、克拉苏等人征战不休的塞琉古帝国。埃及由部将托勒密继承，这就是埃及的托勒密王朝，直传到后世和凯撒结婚的埃及艳后克莉奥佩特拉为止。
当时（普鲁塔克说）无人怀疑他是遭人下毒而死，但有一说谓5年后出现一些讯息，其母奥林匹亚丝因此处死多人，并命人将安提帕特之子（斟酒官）艾欧拉斯（Iolas）的骨灰散入风中，因推断是他下的毒。若干史学家指出，向安提帕特献计谋害国王者是亚里士多德，毒药完全乃由他所提供。
曾统治大半个已知世界的君王死后，各种传言到处流传，实不足为奇。下毒者是艾欧拉斯的说法很快就传遍雅典，雄辩家狄摩西尼提议大家表决向艾欧拉斯致谢。有些传到今天但极缺乏佐证的故事，或可支持亚历山大和赫菲斯蒂安不是死于自然死因的说法。有一则是说有个马其顿军官，他曾目睹哈马丹及巴比伦发生的事。到亚历山大自印度归来时，他怕自己是下一次整肃的目标，便去请教算命者，他该怎么办？算命者要他不必担心；赫菲斯蒂安和亚历山大将不久于人世。
没过几天赫菲斯蒂安果然死了，一年内亚历山大也撒手人寰，两人均在饮下纯酒之后，死于原因不明的高烧。（有位医师自药理学角度提出看法，认为慢性番木鳖碱中毒是最可能的解释。无论是否事出巧合，亚里士多德的弟子兼友人植物学家锡奥夫拉斯特斯，曾提及此物的用途及剂量，并说“掩盖其苦味之上策，即使用于纯酒中”。）
后来也有些说法，说是亚里士多德自己动的手，因为他发现自己协助制造了一个祸害，但普鲁塔克最多只肯说：“初时亚历山大对亚里士多德评价极高，敬爱他超过其父……但最后几年渐渐对他产生怀疑。他从未实际害及他，但其友谊已丧失原有之热情与爱，显见两人已渐行疏远。”与许多有关亚历山大的事迹一样，我们永远无法得知真相如何。
因酗酒和因中毒造成的肝衰竭，症状当然有相似之处。今天多数的学者否定中毒的说法，但也有人不排除亚历山大和赫菲斯蒂安是被毒死的。一群感到幻灭而愤怒的高级军官，密谋毒死亚历山大并不是不可能。他的许多昔日好友及亲信，如今因亲眼的见闻、东方化的奢糜作风、动辄杀人的暴怒，以及也许是最糟糕的自封为神，而感到胆寒。他们觉得他已变成暴君、为所欲为、喜怒无常。亚历山大的老师亚里士多德自己就说过：“无人可自由地忍受如此统治。”
因为亚历山大死时年轻，又保持不败纪录，人们做了许多猜测，假如他活着会发生什么事，假如他挥军入侵西地中海诸国，他很可能获得成功，那么西欧的全部历史就会迥然不同。这样的猜测尽管有趣，但对评价亚历山大的实际影响没有多大关系。
亚历山大是历史上最富有戏剧性的人物，他的经历和个性一直是力量的源泉。有关他生涯的确凿事实十分富有戏剧性，有关他的名字就有许多种传说。他的志向显然是做一名不受时空间限制的最伟大的勇士，似乎也应该给予他这种称号。作为战士，他智勇双全；作为将军，他无与伦比。在11年的奋战中，他从未打过一次败仗。
然而他还是亚里士多德的弟子，是一位智慧非凡的人。他珍爱荷马诗歌。他认识到了非希腊人不一定是野蛮人，这确实表现了他远比当时的大多数希腊思想家更具有远见卓识。但是，在其它方面，他却目光短浅，令人瞠目。虽然他多次在战斗中冒过生命危险，但是却没有安排接班人，这是他死后马其顿帝国迅速瓦解的主要原因。
一般认为，亚历山大是位颇受人喜爱的人物。他对被击败的敌人经常给予无微不至的关怀、爱护和慰藉，但另一方面，却生性凶暴残忍，极端自私自利。有一次因酒后争端，他亲手杀死了他的亲密朋友、救命恩人克雷特斯。
同拿破仑、希特勒一样，亚历山大对他的同代人有着极其广泛的影响。他在短时期的影响不如他们大概主要是因为当时的交通和通信手段落后，使他的影响限制在地球的一个较小的范围内。
从长远的观点来看，亚历山大征服所带来的最重要的影响是使希腊和中东开化民族开始相互密切往来，因此极大地丰富了这两个民族的文化。在亚历山大在世期间及其死后不久，希腊文化迅速传入伊朗、美索不达米亚、叙利亚、竹地尔和埃及；而亚历山大以前的希腊文化仅以缓慢的速度传入这些地区。亚历山大还把希腊的影响播及以前从未到达的印度和中亚地区。但是文化影响决不是单向传播的事。在希腊文化时代（亚历山大征服后的几百年间），东方思想，特别是宗教思想就传入了希腊世界。就是这种希腊文化──主要指具有希腊特征但也深受东方影响的文化，最终对罗马产生了影响。
