在荧光定量PCR中，模板定量有相对定量和绝对定量两种策略。相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因主要是用于核苷酸拷贝数的比较，反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素，通常选用的管家基因有GAPDH、β－2微球蛋白和rRNA。绝对定量FQ－PCR是利用标准品作一条标准曲线，通过标准曲线对样本进行定量，可以通过化学合成目的基因；或是将PCR扩增产物直接梯度稀释；或是将PCR产物克隆到载体上，然后抽提出质粒，经过测量浓度和拷贝数可准确定量，它的优点是稳定、准确。实时荧光PCR技术正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备工具。
（三）荧光定量PCR技术的主要类型
1．非探针类
常见的为SYBR荧光染料，在PCR反应体系中，加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
2．探针类
TaqMan荧光探针是其中最常见的一种。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，每扩增一条DNA链，Taq酶的5′－3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，溶液中就增加一个荧光分子，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
（1）TaqMan技术TaqMan技术原理是，利用Taq酶的5′外切酶活性，即天然的5′→3′核酸外切酶活性，裂解双链DNA 5′端的核苷酸，释放出单个或寡核苷酸，裂解的最佳底物是被置换了的具有又样结构的单链DNA，水解作用发生于结合了置换部位的磷酸二酯键处。基于Taq酶的此种特性，设计合成一个能与PCR产物杂交的探针，探针的5′端标记一个荧光分子，3′端标记另一个荧光分子，其中3′端的荧光分子能够吸收5′端荧光分子的荧光信号，但当有特异的PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而激活Taq酶的5′外切酶活性，将探针5′端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR数量成比例。因此，根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。其主要不足是：①采用荧光淬灭及双末端标记技术，因此淬灭难以彻底，本底较高；②采用酶外切活性，因此定量时受酶性能影响；③探针标记成本较高，不便普及应用。
（2）Amplisenson技术Amplisensor是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物，另一探针连接一淬灭物，两探针的长度不同，其中淬灭物标记探针5′端多出7个碱基（GCGTCCC），PCR扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式PCR引物连接，PCR引物的5′端应有一段与长探针互补的序列，以便连接酶将该引物与短探针连接。扩增时该探针－引物复合物作为半套式引物掺入到模板，从而释放出淬灭探针部分，破坏FRET，产生荧光。荧光强度与扩增时加入的模板数成正比。该方法的主要特点：①每次PCR反应前，需进行Amplisensor标记，增加了操作步骤和检测成本；②采用半套式PCR扩增提高了灵敏度。但无法区分因引物二聚体形成的非特异扩增信号，易造成假阳性；③反应中需加入半套式引物，污染的机会增加。
（3）Molecular beacon技术亦称分子信标法，分子信标是一段荧光标记的单链寡核苷酸探针，其链由两部分组成，一部分是能与靶基因碱基序列互补的寡核苷酸序列，是检测靶基因的部分，位于探针的中间位置，探针形成后构成探针的环部，另一部分是分别在5′和3′端的荧光标记物质和荧光淬灭剂。5′和3′端有几个互补的碱基存在，因而可形成两端反转配对，构成探针的茎部。在游离状态下，分子信标形成茎环发夹结构，使荧光剂和淬灭剂紧密接触，导致荧光淬灭，此时茎环结构的分子信标发出的荧光检测不到。而在PCR变性过程中，靶基因双链打开成单链完全互补，则经复性即可发生杂交。杂交的结果使探针5′和3′端分离，淬灭剂对荧光剂的淬灭作用消失，产生荧光。而在PCR的延伸阶段，分子信标又从模板上解离，重新形成茎环结构，荧光消失。随着每次扩增产物的增加，其荧光强度也增加，因而它可反映每次扩增末期扩增产物积累的量。该方法的特点是采用非荧光染料作为淬灭分子，因此荧光本底低。其不足之处是：①杂交时探针不能完全与模板结合，因此稳定性差；②探针合成时标记较复杂。
（4）Lightcycler技术Lightcycler是Roche公司近年来开发的一种PCR定量技术。该技术的特点也是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发生探针和淬灭探针，前者5′端连接荧光分子，后者3′端连接淬灭分子，由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交。杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子紧密相邻，从而发生FRET使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成正比，以此可进行PCR定量分析。该方法的特点是淬灭效率高，但由于两种探针结合于模板上会影响扩增效率。此外，由于需要合成较长的探针，成本较高。
（5）复合探针法（Complex probes）该法的基本原理则综合了Lightcycler和Molecular beacon两种技术的优点，并克服了它们的不足。首先合成两个探针，一是荧光探针（25bp），5′端接一荧光分子，另一为淬灭探针（15bp），3′端接一淬灭分子，淬灭探针能与荧光探针5′端杂交。当两探针结合时，荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸收，溶液中没有荧光产生，但两探针分离时，荧光探针发出的荧光不再被淬灭探针吸收，溶液中即可检测到荧光。当PCR扩增时溶液中无模板时，两种探针特异性结合，从而使两探针分离，产生荧光。荧光强度与溶液中模板数量成正比，因此，可进行PCR定量。其优点：①使用非荧光淬灭剂，本底低；②对扩增效率影响小；③探针设计、合成、标记、纯化方便。
（四）实验步骤
基本步骤包括：①设计引物，溶解成为10mmol／L的浓度。②提取RNA，反转录成cDNA。③常规PCR以实验所得模板扩增看家基因40个循环，电泳看产物多少。如果少，则不能进行real－time PCR操作。④编写好程序，加样，上机。⑤分析结果。
1．针对目的基因序列选择合适的扩增片断
查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT－PCR的扩增引物，探针以及反应条件。
RTPrimerDB（http：／／medgen．ugent．be／rtprimerdb）
PrimerBank（http：／／pga．mgh．harvard．edu／primerbank／index．html）
Real Time PCR Primer Sets（http：／／www．realtimeprimers．org）
如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考，以下的设计方案仅供参考。
①最广泛使用的商业化的软件Beacon esigner（http：／／www．premierbiosoft．com）。
②DIY的软件Primer Express。
③如果Beacon Designer无法得到需要的结果，或者获得到设计方案的备选数目不够的话，可以选择Sigma－Genosys（http：／／www．designmyprobe．com）的服务方案。
④一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序http：／／www．biosearchtech．cn／products／probe design．asp。
可挑选其中的4～6对引物进行实验，选择引物的扩增效率和灵敏度高的。这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对，并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR。
2．反转录
采用Super Script First－strand Synthesis System的逆转录过程简介（参考Invitrogen的操作指南）
（1）RNA／引物混合物
Total RNA 5μg
random hexamers（50ng／μl）3μl
10mmol／L dNTP mix 1μl
DEPC H（下标2）O to10μl
（2）65℃孵育5min后，冰上1min。
（3）准备反应混合物
10×RT buffer 2μl
25mmol／L MgCl（下标2）4μl
0．1mol／L DTT 2μl
RNAase OUT 1μl
（4）将步骤（3）的反应混合物加入步骤（1）的试管中混合，室温放置2min。
（5）室温，每管中加入1μl（50 U）的SuperScriptⅡ，混合后在25℃孵育10min。
（6）42℃孵育50min，70℃高温灭活15min后放于冰上。
（7）加1μl的RNase H，37℃孵育20min。
（8）反转录生成的cDNA可以－20℃保存或直接用于进行定量PCR反应。
3．实时定量PCR
（1）首先要准备引物和TaqMan Probe：将引物稀释为工作浓度10μmol／L，探针也溶解成10μmol／L的浓度。
（2）制做标准曲线：需要至少4个不同稀释倍数的样本，浓度在10（上标2）～10（上标5）之间。
（3）配制iQ Supermix（BioRad），Supermix含有PCR反应所需的dNTPa、buffer、Mg（上标2＋）等。
（4）混合cDNA模板和Supermix即可放入仪器中进行分析。20μl的Supermix可以加入5μl的cDNA模板，同时设立不加入cDNA模板的对照。
4．Real－time PCR仪操作
（1）开机顺序（光源→PCR→PC→放入样本盘）
（2）设定样本盘的排列顺序与PCR温度每个实验的温度程序设定都不相同，举例如下。
50℃2min，1 yele
95℃10min，1 cycle
95℃15s－＞60℃30s－＞72℃30s，40 cycles
72℃10min，1 cycle
（3）上机开始PCR反应，约1．5～2h完成实验。
PCR反应结束后，可以每个反应管中取5μl通过3％的琼脂糖电泳分析PCR反应产物的特异性。
