一、方法提要
本实验系将实验样品接触培养细胞，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察，评价实验材料对体外细胞的毒性作用。
二、试剂
氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、葡萄糖、酚红、台盼蓝、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、胰蛋白酶、Ea出培养基、RPMI 1640培养基、胎（小）牛血清、青霉素G（钠盐）、硫酸链霉素、乙醇、苯酚、二甲基亚砜（DMSO）。
三、主要设备和用具
超净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴箱、电冰箱、倒置显微镜、光学显微镜、压力蒸汽灭菌器、抽滤瓶、磁力搅拌器、培养板（皿）、液氮罐或超低温冰箱、天平。
四、细胞株
实验用细胞株可采用ATCC CCL1［NCTC clone 929（小鼠成纤维细胞）或其他适宜细胞。实验采用传代48～72h生长旺盛的细胞。
五、实验前准备
1．器具灭菌
与实验和对照样品接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min，或置电热干燥箱内160℃2h。
2．无菌窒要求
无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。
3．细胞培养基、细胞消化液、平衡盐溶液制备（见附录八）
4．实验样品制备
（1）无菌实验材料直接取样实验。灭菌实验材料宜采用与成品相同的灭菌过程或其他适宜方法灭菌。
（2）需制备浸提液时可采用含血清（或无血清）细胞培养基或质量浓度为9g／L的氯化钠注射液为浸提介质，制备方法按GB／T 16886．5的规定。
5．对照品制备
（1）阴性对照品可采用经确认过的不产生细胞毒性反应的材料，例如高密度聚乙烯。
（2）阳性对照品可采用经确认过的可重现细胞毒性反应的材料，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯、质量浓度为5g／L的苯酚溶液或体积分数为5％的甲基亚砜（DMSO）溶液。
（3）需制品浸提液时，常规浸提条件见表4—2l。
表4—2l常规浸提条件
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浸提温度（℃）浸提时间（h）浸提设备
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6．实验步骤
（1）总则根据实验材料特性选择下列实验中的一种或多种适宜方法进行评价。
（2）浸提液实验
①四盐（MTT）比色法：将配置好的1×10的四次方／ml细胞悬液接种于96孔培养板，设置空白对照、阴性对照和实验样品组，每组各设至少6孔，每孔接种100μl细胞悬液。置二氧化碳培养箱（含体积分数5％二氧化碳气体，下同）37℃培养24h后，弃去原培养渡。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入阴性对照品浸提液，阳性对照组加入阳性对照溶液或阳性对照品浸提液，实验样品组加入实验材料浸提液，每孔100μl，置二氧化碳培养箱继续培养72h。
注：如采用质量浓度为9g／L的氯化钠注射液为浸提介质时，需使用浓缩培养基将浸提液稀释至规定浓度。
72h后，置显微镜下观察细胞形态。每孔加入20μl质量浓度为5g／L的MTT溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，加入150μlDMSO，置振荡器上振荡10min，在酶标仪570nn和630nm波长下测定激光度，按下式计算相对增值率：
RGR=A／A0×100％
式中，RGR为相对增值率，％；A为实验样品组（阴性、阳性对照组）吸光度；A0为空白对照组吸光度。
根据RGR按表4—22分级判定。阴性对照组的反应应不大于1级，阳性对照组至少为3级反应。如阴性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新实验。
表4—22细胞毒性反应分级
②显微镜观察法：将配置好的1×10的5次方／ml细胞悬液接种于直径35mm培养皿内，每皿2ml。置二氧化碳培养箱37℃培养至近汇合单层细胞形成。
弃去原培养液。阴性对照组加入阴性对照品浸提液，阳性对照组加入阳性对照液或阳性对照品浸提液，实验样品组加入实验材料浸提液，每皿各加2ml。每组平行操作3皿，置二氧化碳培养箱继续培养72h。
注：如采用质量浓度为9g／L的氯化钠注射液为浸提介质时，需使用浓缩培养基将浸提液稀释到规定浓度。
置显微镜下观察，按表4—23分级判定。阴性对照组成为0级反应，阳性对照组至少为3级反应。如阴性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新实验。
表4—23细胞毒性反应分级
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级别反应程度反应观察
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0
无细胞形态正常，贴壁生长良好，胞浆内有离散颗粒；无细胞溶解
1极轻微至多20％的细胞呈圆形，疏松贴壁，无胞浆内颗粒；偶见细胞溶解
2轻充至多50％的细胞呈圆形，无胞浆内颗粒，明显可见细胞溶解和细胞间空区
3中度至多70％的细胞呈圆形或溶解
4重度细胞层几乎完全破坏
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③直接接触实验：本实验不适宜于极低密度和高密度材料，可能会导致细胞物理性损伤。
实验和对照材料应处置成直径为10nm的圆片或表面积约为100mm的平方，接触细胞面为平面。
将配置好的1．5×10的5次方／ml细胞悬液接种于直径35mm培养皿内，每皿2ml。置二氧化碳培养箱37℃培养至汇合单层细胞形成。
弃去原培养液，每皿加入2ml新鲜细胞培养基。将实验和阴性对照、阳性对照样品分别轻轻放入培养皿内，每皿放置一片样品，使其沉于皿底与细胞单层直接接触。每组平行操作3皿。置二氧化碳培养箱继续培养48h。
置显微镜下观察，按表4—24分级判定。阴性对照组应为0级反应，阳性对照组至少为3级反应。如阴性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新实验。
衰4—24细胞毒性反应分级
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级别反应程度反应观察
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0无样品下面和周围区域细胞无异常迹象
1极轻微样品下面有细胞出现形态异常或退化迹象
2轻度细胞反应区域局限在样品下方范围或超出样品边缘小于5mm
3中度细胞反应区域超出样品下方范围6—10mm
4
重度细胞反应区域超出样品下方范围10mm以上
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7．结果评价
在阴性对照和阳性对照产生预期反应的情况下，分析评价实验样品细胞毒性反应程度。
8．实验报告
实验报告中应给出下列信息。
（1）实验材料名称。
（2）批号。
（3）实验和对照样品制备。
（4）实验用培养基、细胞株制备。
（5）实验步骤。
（6）细胞反应和其他情况。
（7）观察结果。
（8）结果评价。
