无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净窒（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度必须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
一、培养基
（一）培养基的制备及培养条件
培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证台格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2～25℃，避光的环境。若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。
1．硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌氧菌）
酪胨（胰酶水解）15．0g酵母浸出粉5．0g
葡萄糖5．0g氯化钠2．5g
L—胱氨酸0．5g新配制的0．1％刃天青溶液1．0 ml
硫乙醇酸钠0．5g琼脂0．75g
（或硫乙醇酸）（0．3ml）水1000ml
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH使灭菌后为7．1±0．2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度1／2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1／5，否则，需经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20min），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。
2．改良马丁培养基
胨5．0g磷酸氢二钾1．0g
酵母浸出粉2．0g硫酸镁0．5g
葡萄糖20．0g水1000ml
除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH约为6．8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节PH使灭菌后为6．4±0．2，分装，灭菌。
改良马丁培养基置23—28℃培养。
3．选择性培养基按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证实验。
4．0．5％葡萄糖内汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）胨10．0g氯化钠5．0g
葡萄糖5．0g水1000ml
牛肉浸出粉3．0g
除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节PH为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH使灭菌后为7．2±O．2，分装，灭菌。
5．营养肉汤培养基
胨10．0g氯化钠5．0g
牛肉浸出粉3．0水1000．ml
取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸滤清，调节pH使灭菌后为7．2±0．2，分装，灭菌。
6．营养琼脂培养基
按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入14．0g琼脂．调节pH使灭菌后为7．24±0．2，分装，灭菌。
7．改良马丁琼脂培养基
按改良马丁培养基的处方及制法，加入14．0g琼脂，调节pH使灭菌后为6．4±0．2，分装。灭菌。
（二）培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
（三）无菌性检查
每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养14天，应无菌生长。
（四）灵敏度检查
1．菌种
培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证实验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]
铜绿假单胞菌（Pseudomonas）[CMCC（B）10104]
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]
生孢梭菌（Ctostridium sporagenes）[CMCC（B）64941]
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]
黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]
2．菌液制备
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基巾，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18—24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，23～28℃培养24～48h，上述培养物用0．9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100CFU（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5—7天，加入3～5ml含0．05％（ml／ml）聚山梨酸酯80的0．9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，含0．05％（ml／ml）聚山梨酸酯80的用0．9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100CFU的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2h内使用；若保存在2～8℃，可在24h内使用。黑曲霉孢子悬液保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
3．培养基接种
取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9立，分别接种小于100CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100CFU的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。
4．结果判断
空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
二、稀释液、冲洗液及其制备方法
稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
（1）0．1％蛋白胨水溶液取蛋白胨1．0g．加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH至7．1±0．2，分装，灭菌。
（2）pH7．0氯化钠一蛋白胨缓冲液取磷酸二氲钾3．56g、磷酸氢二钠7．23g、氰化钠4．30g、蛋白胨1．0g．加水1000ml，微微溶解，滤清，分装，灭菌。
根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液，冲洗液。如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
方法验证实验：
当建立药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每实验菌应逐一进行验证。
1．菌种殛菌液制备
除大肠埃希菌[CMCC（B）44102]外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，生孢梭菌，白色念珠菌，黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制各同金黄色葡萄球菌。
2．薄膜过滤法
取每种培养基规定接种的供试品总量，按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100CFU的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培养摹加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。接规定温度培养3～5天。各试验菌同法操作。
3．直接接种法
取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于1OOCFU的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100CFU的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，按规定的温度培养3—5天。
4．结果判断
与对照管比较，如含供试品各容器中的实验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。如果供试品的任容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量，或增加培养基的用量，使用中和剂或灭活剂或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。
方法验证实验也可与供试品的无菌检查同时进行。
三、供试品的无菌检查
1．检验数量
检验数量是指一次实验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产品按表4—13规定；七市产品监督检验按表4—14、表4—15规定。表4—13、表4—14、表4—15中最少检验数量不包括阳性对照实验的供试品用量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1／2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量做船性对照用。
表4—13批出厂产品最少检验数量
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供试品批产量N（个）每种培养基最少检验数量
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注射剂≤100 10％或4个（取较多者）
100＜N≤500 10个
＞500 2％或20个（取较少者）
大体积注射剂（＞100ml）2％或10个（取较少者）
眼用及其他非注射产品≤200 5％或2个（取较多者）
＞200 10个
桶装固体原料≤4每个容器
4＜N≤50 20％或4个容器（取较多者）
＞50 20％或10个容器（取较多者）
抗生素原料（≥5g）6个容器
≤100 10％或4件（取较多者）
