溶解度差、毒性较低的受试物，可以产生沉淀的最低溶液浓度为最高剂量浓度；毒性较大的受试物，应检测受试物的毒性剂量，可以50％细胞生长抑制浓度为最高剂量浓度。浓度一般不超过5mg／ml，中低剂量组可采用倍量稀释法稀释，最低剂量浓度可略有或没有细胞毒性。
2．正式实验
将生长良好的CHL细胞以PBS液处理，使成1×10（上标4）～2×10（上标4）浓度菌悬液，37℃培养48h后，按实验设计分组（阳性对照组、阴性对照组、溶剂对照组、至少3个剂量的受试物组）加入各种溶液，混匀，37℃培养3～6h。换液，洗涤细胞，加培养液继续培养22h，取出，进行消化、固定、染色，制作染色标本。
若需活化处理时，加S9mix，37℃培养48h后，按实验设计分组（阳性对照组、阴性对照组、溶剂对照组、至少3个剂量的受试物组）加入各种溶液，混匀，37℃培养3～6h。换液，洗涤细胞，加培养液继续培养22h，取出，进行消化、固定、染色，制作染色标本。
3．结果观察
油镜观察计数至少100个中期分裂细胞。畸变包括染色体断裂、单体、环状（着丝点环、无着丝点环）、倒位、易位、碎片或粉碎、多倍体为染色体数目变化等。
（四）结果判定
染色体畸变率＜4．9％为阴性；畸变率≥10％为阳性；畸变率在5．0％～9．9％之间，为可疑阳性。染色体畸变率≥10％，且有剂量反应关系，或某剂量组重复结果也为阳性时，或受试物组比对照组细胞畸变率有显著性增高时，均可判为阳性。若出现可疑阳性时，应进一步实验或增加其他实验进行综合评价。
三、哺乳动物细胞基因突变实验
（一）原理
细胞在正常培养条件下，对6－硫代鸟嘌呤（6－TG）的毒性作用敏感，不能生存，在致癌物或致突变物作用下，某些细胞X染色体上控制次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的结构基因发生突变，不能再产生HGPRT，从而使突变细胞对6－TG具有抗性作用。这些突变细胞在含有6－TG的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。根据集落形成数，计算突变率以判定受试物的致突变性。
常用的进行哺乳动物培养细胞基因突变实验的细胞株为中国仓鼠肺细胞（V79）和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）。
（二）实验准备
1．实验仪器
生物显微镜、倒置显微镜、低温冰箱（－80℃）或液氮罐、生物安全柜、二氧化碳培养箱、恒温水浴、高压蒸汽消毒器、电热干燥箱、抽滤装置、离心机等。
2．实验材料
细胞：中国仓鼠肺细胞（V79）和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）。实验前先将野生型细胞接种于含次黄嘌呤及胸腺嘧啶、甲氨蝶呤、甘氨酸的MEM培养液中，以选择性杀灭自发HGPRT座位突变体。
培养液：市售或用MEM培养液加入10％胎牛血清和适量抗生素（青霉素、链霉素）。
阳性对照物：常用甲磺酸乙酯（EMS）、丝裂霉素C（MMC）、甲基硝基亚硝基胍（MNNG）、苯并（a）芘（BP）等。
活化系统：S9、S9mix，按AMES实验准备。
（三）实验方法
1．剂量设计
一般应设4个以上剂量组，溶解度差、毒性较低的受试物，可以产生沉淀的最低溶液浓度为最高剂量浓度；毒性较大的受试物，其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性，高浓度组细胞相对存活率应为10％～20％；毒性较低且溶解性较好的受试物，最高浓度一般不超过5μl／ml、5mg／ml或0．01mol／L。受试物最好选择培养液作为溶剂，也可溶于二甲基亚砜（DMSO）。
2．正式实验
实验前一天，将细胞接种于培养瓶中，放入二氧化碳培养箱37℃培养24h。换液，洗涤细胞，加培养液及受试物继续培养2h，吸去含受试物的培养液，用Hanks液洗涤细胞，加入含胎牛血清的培养液继续培养约20h。若需活化处理时，加S9mix，不加S9mix的受试物，用培养液补足。
与受试物接触的细胞培养约20h后，用胰酶－EDTA消化，待细胞脱落后，加入含10％血清培养液终止消化，混匀，放入离心管以800～1000r／min的速度离心5min，弃去上清液，制成细胞悬液，计数，以5×10（上标5）个细胞接种于直径为100mm的平皿，3天后分种一次，仍接种5×10（上标5）个细胞继续培养3天。
3．结果观察
细胞毒性测定：将首次消化计数后的细胞以每皿200个接种，每组5皿，二氧化碳培养箱37℃培养7天，固定，Giemsa染色，计数每皿集落数，以相对于溶剂对照组的集落形成率表示细胞毒性。以溶剂对照的集落形成率为100％，求出各实验剂量组的相对值。
A＝B／C×100
式中：A为相对集落形成率；B为实验组集落形成率；C为溶剂对照组集落形成率。
突变体的选择及集落形成率的测定：将分种后培养的细胞进行消化，再分种，每组5皿，每皿2×10（上标3）个细胞，待细胞贴壁生长良好，加入6－TG，使最终浓度达5μg／ml，二氧化碳培养箱37℃培养8～10天，固定，Giemsa染色，计数每皿集落数，计算突变率。同时另作集落率测定。每皿接种200个细胞，不加6－TG，每组5皿，7天后固定、染色，计数集落形成率。
D＝B／C
式中：D为集落形成率；E为实际存活的细胞集落数；F为接种细胞数。
G＝（H／I）×（1／D）
式中：G为突变率；H为突变集落数；I为接种细胞数；D为集落形成率。
（四）结果判定
（1）若阴性对照中，集落形成率低于50％，结果应不采用。
（2）各实验室选用的阳性对照突变率有一定范围；若受试物的结果为阴性或弱阳性，阳性对照的诱变率应达正常值的下线以上，否则结果不能成立。
（3）当突变率为自发突变率的3倍或以上，或至少在3个浓度范围内突变率有随浓度递增而升高的剂量反应关系时，可判为阳性。
四、啮齿动物骨骼微核实验
（一）原理
微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，它是染色体断裂遗落下来的断片，在细胞繁殖过程中被子细胞排除而形成的小核，大小相当于细胞直径的1／20～1／5，是染色体损伤的一种表现。通过计数小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）中含微核的嗜多染红细胞数，判断受试物是否具有诱发遗传毒性作用。嗜多染红细胞在骨髓中为无核的幼稚红细胞，数量充足，胞浆中微核容易辨认，且自发微核率低。
（二）实验准备
1．实验仪器
生物显微镜、离心机等。
2．实验材料
小牛血清、Giemsa染液、Giemsa应用液、磷酸盐缓冲液（pH范围6．8）等。
3．实验动物
小鼠。
（三）实验方法
1．剂量设计
取健康小鼠50只，随机分成5组（阴性对照组，阳性对照组，高、中、低剂量组），每组10只，雌雄各半。阴性对照组以生理氯化钠溶液给药，阳性对照组以环磷酰胺给药，高剂量组以1／2LD（下标50）为剂量，中剂量组以1／4LD（下标50）为剂量，低剂量组以1／8LD（下标50）为剂量。
对求得LD（下标50）的受试物可采用一次给药；对无法求得LD（下标50）的受试物以最大耐受量为最高剂量，可采取一日内多次给药。
2．正式实验
于末次给药24h处死小鼠，取出双侧股骨，擦净血迹，剔除肌肉，剪去股骨两端，用吸有小牛血清的注射器针头插入股骨一端，用小牛血清将骨髓冲入离心管，每根股骨冲入约1ml小牛血清。离心，弃去上清液，制片、固定、染色、晾干。
3．结果观察
油镜观察按一定顺序计数，每只动物至少计数1000个嗜多染红细胞（呈浅蓝色或蓝灰色）中含有微棱的细胞数（MN－PCE），并以千分率表示。每只小鼠还要计数200个嗜多染红细胞和无核红细胞（呈粉红色），并计算嗜多染红细胞和无核红细胞的比值P／N，若P／N≥1，计量选择适合，若P／N＜1，提示受试物剂量过大或受试物具有细胞毒性。
（四）结果判定
应先分别计算雌雄动物微核千分率，当雌雄动物微核率无明显差别时，再将雌雄动物微核率合并计算。多采用t－检验比较给药组与对照组的微核差异。P／N的比值采用t检验，当受试物诱发的微核率增加与计量相关，其中一剂量组与对照组比较有显著性差异时，可判定为微核阳性；若某剂量组与某一测试点出现可重复性的、有统计意义的微核率增加，也可判为阳性。
（五）附注
一般昆明小鼠的自发微核率为1‰～4‰，NIH小鼠的自发微核率为0．5‰～2‰，各种品系小鼠的自发微核率均不超过5‰。
五、小鼠淋巴瘤细胞TK实验（MLA）
MLA实验是以小鼠淋巴瘤15178Ytk＋／－3．7．2C细胞中11号染色体上存在的杂和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）基因突变频率为指标的基因突变方法。MLA不仅可以检测点突变等较小的基因突变，也可监测染色体水平和较大的缺失等基因突变，具有较大突变的细胞增殖速度很慢而形成小细胞集落，这些小细胞集落多为染色体异常，因此MLA实验与染色体畸变实验有较高的一致性和灵敏性，染色体畸变实验和MLA实验阳性物质一致率在90％以上，因此现在国际上认为遗传毒性实验标准组合中选择染色体畸变实验和MLA实验均可。
