①当出现翻正反射有疑问时，则重新轻轻使动物背部朝下仰卧，如果1min内出现翻正反射，该时间即为翻正反射恢复时间，否则即为入睡时间。
②应该严格区分是安全范围内的镇静催眠作用，还是药物毒性引起的中枢抑制作用。
③水溶性药物，配成生理氯化钠溶液或蒸馏水液可以任何途径给药；用酸碱溶解者可用碱酸调节，使pH在4～9的范围。
④用乙醇、丙二醇、DMSO助溶的药物，或用吐温60、吐温80、阿拉伯胶、2％～3％淀粉、0．5％羧甲基纤维素等制成的药物混悬液，可腹腔或皮下注射和口服，但必须设相同浓度的溶剂对照组。
⑤用注射用花生油配成的溶液或乳剂，可以口服也可皮下或肌内注射。
⑤液量，小鼠一般为0．1ml／10g。
（二）心血管系统
测定并记录给药前后血压（包括收缩压、舒张压和平均压）、心电图（包括Q－T间期、P－R间期、ST段和QRS波等）和心率等的变化。
1．直接测定法
【基本原理】将导管一端插入动脉中，另一端连至各种检压计以测定血压的方法叫直接测压法。目前采用各种类型压力换能器，其基本功能就是将压力信号转变为电信号，经放大系统记录在生理记录仪上或计算机上，能较精确地测定心动周期中各瞬间的血压值。近年发展的遥控测压法，采用可植入微型压力发送器（含压力换能器）连续感受、处理和发送信号，依靠接收器遥控检测压力发送器的发送信号并输送至计算机记录、处理、分析。心脏在兴奋中，兴奋的产生、传导及恢复可通过心脏周围组织和体液传播到身体表面。利用表现电极从体表不同部位将心肌电变化引导到心电图机，所记录到的电变化，即为心电图（ECG）。
（1）麻醉动物直接测定法
【操作步骤】
①麻醉：最常用的麻醉剂为戊巴比妥钠，狗一般用30mg／kg，静脉注射或腹腔注射麻醉，大鼠用40mg／kg腹腔注射麻醉，兴奋型狗的麻醉剂量可增至35～40mg／kg，最好采用静脉注射，便于掌握剂量。戊巴比妥钠麻醉维持时间为2～4h，若手术或实验时间短，可用硫喷妥钠。大鼠还常用乌拉坦1000～1500mg／kg腹腔注射麻醉，麻醉深而平稳，24h还不能完全恢复。
②固定动物：将动物仰卧位固定在手术台上，注意四肢不可束缚过紧以免影响血液循环，用线绳通过门齿将颈部拉直以便手术操作。
③手术视野剪毛。
④动脉插管：一般选用颈动脉或股动脉进行插管。颈动脉插管时，沿胸锁乳突肌内缘将筋膜分开，即可见颈总动脉迷走神经混合干，将动脉和神经分开，分离甲状腺动脉以下的颈总动脉一段（2～4cm），下穿两根线，用一根线结扎血管远心端，用动脉夹夹住血管近心端，然后在血管上剪一小口，插入动脉导管（插管前将导管和压力换能器内充满0．3％肝素生理氯化钠注射液，排走气泡），并用另一根线固定。股动脉插管时，在腹股沟处用手触及股动脉搏动，在其表面作股动脉走向的皮肤切口，分离皮下组织，暴露股动脉、股静脉，分离股动脉，按上述方法插入动脉导管，如需静脉给药或补液，可同时作颈外静脉或股静脉插管。若给药次数不多，也可采用舌静脉给药，即将舌拉出，把药液直接注入舌静脉。
⑤血压记录：将动脉导管与压力换能器相连，信号经放大后记录于生理记录仪上或计算机上，可记录收缩压、舒张压、平均动脉压等，也可记录血压波形。
⑥心电图记录：将三个电极分别接上三根金属针头，对应插入狗的右前肢（与心电图机的负极端相连）、左后肢（与正极端相连）和右后肢皮下。将心电导联连接于心电图机或生物机能实验系统，记录Ⅱ导联心电图或计算机自动采集并保存信息。测量心率、心律、P波、P－R间期、QRS时间、Q－T间期、R波、T波、ST段。
【结果评价】测量给药前及给药后各个时间点动物的收缩压、舒张压、心率等，计算平均值及SD值。将给药后各个时间点的上述指标与给药前进行t－检验比较，若P＜0．05，表明被试药物对血压有影响。
【方法要点】
①手术要仔细、柔和，勿损伤小血管，出血时要迅速止血，分离大鼠股静脉时，更要细心柔和，否则静脉塌陷难以插管。狗的皮肤易出血，可用烧灼法止血。
②压力换能器应预先定标。动脉导管内预先充满0．05％的肝素生理氯化钠溶液，以防血液凝固。如实验过程中发生导管内凝血或脉压差过小，可经三通管用少量0．05％的肝素生理氯化钠溶液冲洗。静脉导管内充满生理氯化钠溶液即可。动脉导管和压力换能器之间整个系统的空气必须排尽，微小气泡的存在将影响血压波形的真实性。
③麻醉深浅可影响实验结果，故应保持麻醉深度平稳。麻醉对心血管功能和药物反应有不同程度影响，这是本法最大的不足。
④麻醉可引起热量散失，多数情况下并不构成生命威胁，但由于自身调节功能下降，严重时可导致寒战或心脏骤停，影响实验现象的观察及实验结果的准确性，所以麻醉中体温保持相对恒定对实验成功至关重要。
⑤描记心电图时，动物应全身肌肉放松，电极和皮肤应紧密接触，防止干扰和基线漂移。
（2）清醒动物遥控测定技术
【基本原理】血压、生物电等生理信号被植入体采集并转换成相应的电信号后用无线电发射出来，由接收器接收到并传递给数据转换器，完成数据转换后送入中央处理器进行数据处理，它最多可同时连接400个接收器，完成大规模的实验。
【操作步骤】将可植入微型远距遥测器植入动物体内。通常采用腹中线切口，将压力发送器导管直接插入腹主动脉，压力发送器体部固定在腹壁肌层。可根据实验需要将心电感应电极放置在相应位置。
实验装置的遥测系统由三个基本部分组成：①可植入微型远距遥测器，植入动物体内，用以连续感受、处理和发送信号；②信号接收器，固定在动物笼内或附近，用以检测生理压力发送器的发送信号，并输送至计算机；③计算机记录处理系统。
【结果评价】直接在体内血管、腔体或腺体内测得的压力值最为稳定、准确，排除了麻醉的干扰，动物的惊扰等引起的偏差，并能长期观测，是目前最好的测量方法。植入微型远距遥测器与接收器、记录系统之间无连接，使动物能真正自由活动，消除束缚系统对动物造成的压力效应。
【方法要点】
①微型远距遥测器需植入动物体内，应避免感染；
②微型远距遥测器的电池有寿命，需定期更换。
2．Q－T间期实验方法
由于药物引发Q－T间期延长可以导致严重的心律失常，如扭转型室性心动过速，尤其是合并有其他危险因素时，常常危及患者生命，潜在的危害性很大。因此，国际上对研发过程中如何评价新药对Q－T间期的延长作用给予了高度的重视。2005年10月美国FAD在ICH的支持下，发布了“评价人用药品潜在致心室复极化延迟作用（Q－T间期延长）的安全药理学研究（S7B）”。该指南不但阐述了目前FAD对此研究领域的基本原则，也提供了目前可用于评价药物是否存在引起Q－T间期延长的潜在不良反应的临床前实验方法、推荐采用的实验方法以及与开发药物临床实验有关的安全药理实验研究的时间安排。
对于评价新药Q－T间期延长作用时，一般推荐的临床前评价的总体思路如下。评价药物是否属于从药理作用或化学结构上易于引起人类Q－T间期延长的家族成员。例如：抗精神病类药物、抗组胺类药物、抗心律失常类药物和氟喹诺酮类药物；心肌离子电流测定的结果；动作电位测定的结果；体内ECG上Q－T间期的测定结果。假如上述结果提示存在潜在的危险时，应进行深入的体内和体外实验研究。最后结合其他方面的实验结果综合评价进一步开发的可能性。选择实验方法时体内和体外实验相互补充，至少应该选择两种方法进行评价。临床前评价的方法包括四个水平上的模型：①采用动物或人类的离体心肌细胞、培养的心肌细胞系或转染有人类离子通道基因的异源细胞表达系统研究离子电流的变化；②用离体心肌组织或麻醉动物测定动作电位或特定的电生理指标的变化；③在清醒或麻醉的动物上测定ECC的变化；④在动物或离体心肌组织上评价药物的致心律失常前期作用。各种水平的模型各具不同的优缺点，体外电生理研究模型可以进行体内实验不具备的细胞水平的作用机制探讨，动作电位的研究反映的心脏中多个离子通道的整体反应的结果，而体内实验中心电图的结果则同时反映了心肌传导特性和非心脏因素的影响等总的结果，同时体内实验可以同时评价代谢产物的影响和安全范围。
各种模型的特点如下。
（1）体外电生理实验，可以研究受试物对动作电位时程和心肌离子电流的作用，同时探讨影响复极化的细胞机制。实验中可以使用单细胞系统，也可以使用多细胞系统。前者有在非心肌细胞系细胞上表达人类离子通道蛋白的异源性表达系统和消化分散处理的心肌细胞，后者有浦肯野纤维、心室乳头肌、心室间隔和离体灌流心脏。异源性表达系统可用于评价对特异性离子通道的作用，分散的单个心肌细胞系统，虽然在技术上难度更大一些，但具有同时评价动作电位时程和离子电流的优点。多细胞系统则是研究动作电位时程的稳定的模型系统。体外实验中使用的组织或细胞可来自家兔、豚鼠、犬、猪、雪貂，有时也可来源于人类。此外，不同的细胞类型和不同部位的细胞在不同离子通道的分布上均存在差异，所以，必须注意标本的来源及其特性。
尽管使用动物或人源性的心室肌细胞有离子通道的组成与临床相近等优点，但细胞分散过程中酶的处理可导致离子通道的功能改变，不易标准化，并且由于经消化分散的原代心肌细胞记录快速激活的迟发性校正电流（Ikr）离子电流时，还存在其他离子电流的影响，而表达hEGR的重组细胞系很少有内源性电流的干扰，易于标准化，因此常常选择稳定的表达K（上标＋）通道蛋白的转染有hEGR基因的哺乳动物细胞系细胞，应用电压钳技术测定Ikr。最常用的细胞系有：中国地鼠卵巢细胞（CHO）、小鼠纤维母细胞（Ltk－）和人胚胎肾细胞（HEK293）。动作电位是多个离子通道整体活动结果在细胞水平的反映，因此，测定动作电位时程（APD）的变化是评价受试物对复极化作用的理想的指标。可以采用多细胞系统（分散的心室肌细胞、浦肯野纤维、心室乳头肌、心室间隔、离体心室肌和离体灌流心脏），也可用在体动物模型进行动作电位的记录。
（2）非做功离体心脏灌流模型，即Langendorff模型，是以恒压或恒流方式，从主动脉根部逆向用氧合盐溶液灌注心脏（逆行灌流）。逆行灌流过程中，主动脉瓣关闭。正如在体心脏处于舒张期一样，使得灌注渡经冠状动脉分布，并流入冠状窦和开放的右房。其优点是可观察心脏的收缩力、冠脉流量及心脏节律等指标。缺点为灌流过程中心室不充盈，不按照容量压力曲线作功，与生理状态偏离较大，所能观察的指标也较少，不能满足心脏复杂功能研究的需要。
（3）离体工作心脏灌流模型，该模型是由Neely等于1967年为克服Langendorff模型的不足建立起来的，即在肺动脉或左心房内插入另一根导管，灌流液可经导管通过二尖瓣进入左心（顺心室灌流），心脏收缩时左心室可克服后负荷将灌流液泵入主动脉而做功。后来根据实际研究的需要，研究者们不断进行改进，逐渐建立了更加完善和成熟的做功心脏灌流模型。通常是先进行Langendorff灌流，待心脏恢复收缩后，再行顺行灌流，心脏开始做功，稳定后进行正式实验。其优点是心脏的活动接近在体条件下的情况，可同时研究心脏舒缩功能、心泵功能、冠脉灌注状态以及心肌氧耗、底物的利用、酶学改变等多项生理功能。缺点为不受整体条件下神经体液的调节作用，且人工灌流液的组成及性状与正常血液相比仍有差异，故不能完全等同于在体心脏。离体心脏维持时间不能过久，实验操作必须在一定时间内完成。
（4）体内的电生理实验，整体动物模型的特点是可以评价在所有离子通道和细胞的总体作用下，对心室复极化和心律的影响。同时，此类模型也包括了神经、体液的影响因素最常采用的观测指标是ECG的Q－T间期，在特定的电生理研究中也可以测量心室复极化的局部信息，如：单相动作电位时程和有效不应期。在选择实验系统时，应考虑不同种属的动物在复极化的离子机制上存在差异。例如，控制成年大鼠和小鼠的心肌复极化的主要离子电流是Ito。不同于大动物和人类。因此，大鼠和小鼠不适合用于体内电生理的研究，选择犬、猴、猪、家兔和豚鼠更合适。常常使用清醒动物评价受试物对Q－T间期的影响，以减少麻醉对动物神经体液反应的干扰。但由于清醒动物在心率和活动状态上存在很大的差异，有时也会使用麻醉动物。清醒动物ECG的记录常常采用遥测技术和动态心电图技术，而受限制动物和麻醉动物则经常会采用传统的ECG记录方法。
3．离体心脏灌流模型
【操作步骤】
（1）仪器装置Langendorff心脏灌流的装置比较简单，主要由贮气囊、Mariotto瓶、贮液瓶、双层灌流槽、恒温加热器及超级恒温水浴锅等组成充气、灌流和恒温三部分。
充气：可用贮气囊直接与贮液瓶相接，也可用小塑料管插入Mariotto瓶。充气时要求气量充足，气泡要小而均匀以免影响灌流液的流速。可通过调整Mariotto瓶的高度来调节灌流压力，要求Mariotto瓶中液面距心脏的高度为70～90cm，按心脏大小适当调整，以冠脉流量为5～8ml／min为宜。
灌流：为使离体心脏表面保持一定的温度和湿度，将心脏置于由有机玻璃制成的双层灌流槽内，其内层容积约为300ml（大鼠、豚鼠心脏约为100ml即可），槽的底部有漏斗形开口。灌流时，灌流液从主动脉进入冠状血管后到右心房经腔静脉及肺动脉滴入槽中，经漏斗形开口流出，收集流出液以测定冠脉的灌流量。
