方法：从单次感染的病毒中分离得到HIV－1 PIC，在96孔板中包被双链靶DNA，加入PIC和待测药物共孵育后洗去PIC，再将发生整合的DNA洗脱，用Taq－Man实时定量PCR检测整合效率。
3．作用于病毒其他分子靶点的化合物的筛选方法
（1）化合物对HIV NCp7蛋白锌指结构的影响HIV－1核衣壳蛋白p7（nucleocapsid protein p7，NCp7）是由蛋白酶切割Gag多蛋白前体产生的一个55氢基酸的小分子碱性蛋白，含有两个在逆转录病毒中高度保守的CCHC型锌指结构，该结构对NCp7的生理功能起着决定性的作用。NCp7可与多种病毒蛋白／核酸以及宿主蛋白相互作用，在HIV－1生活周期的多个阶段多个步骤发挥重要功能，对NCp7抑制剂的筛选日益受到重视。
①紫外检测法：利用NCp7分子中Trp37的紫外吸收特性。分子构象改变时，Trp37暴露，整个分子的紫外吸收改变，通过对光吸收的检测可判断化合物对NCp7构象的影响。
②RNA凝胶电泳迁移检测法：利用NCp7的核酸伴侣特性，在待测药物存在或不存在条件下，用重组的NCp7蛋白与（上标32）P标记的RNA共同孵育，然后进行凝胶电泳。形成的NCp7－RNA复合物在凝胶中的迁移速度将会变慢，若待测化合物能够抑制NCp7的功能，则RNA的迁移速度将不受影响。
③ELISA检测法：在酶标板上包被重组的NCp7，然后在待测化合物存在或不存在的情况下，加入生物素标记的寡核苷酸，作用一段时间后加入链亲和素偶联的辣根过氧化物酶，然后加入其底物显色，检测化合物对NCp7结合寡核苷酸能力的影响。
④锌离子逐出检测法：化合物将锌离子逐出锌指结构可能干扰其与病毒RNA的结合键，从而抑制新感染病毒颗粒的成熟。方法为：基因重组NCp7蛋白，将其中一个锌指结构区域的组氨酸点突变成甲硫氨酸。加入氯化锌使其螯合。在待测化合物存在或不存在时，通过选择性的锌原子结合荧光染料TSQ来检测锌原子的释放。
（2）化合物对HIV调节基因Vpr的抑制作用HIV－1 Vpr蛋白是保守性的Vpr基因编码的小的碱性蛋白质，在病毒的复制中发挥多种功能，许多研究认为Vpr可以促进病毒复制。检测方莹有：①Vpr可以诱导细胞凋亡，通过加入药物后诱导酵母表达Vpr，测量OD值检测细胞的存活率来检测药物对Vpr的影响作用；②病毒样感染性颗粒检测法：分别用Vpr＋和Vpr－的病毒样感染性颗粒在8μg／ml凝聚胺存在下转染1×10（上标6）个Hela细胞2h后，洗涤细胞6次，消化后在384孔板上每孔加入500个细胞，加入待测药物，37℃、5％CO（下标2）培养箱中孵育72h。检测细胞存活率，通过药物对细胞凋亡的保护作用来检测其对Vpr的抑制活性。
（3）Tat抑制剂的筛选方法Tat是HIV复制周期中的一个重要的调节蛋白。Tat结合到HIV病毒基因新生转录5’端59个核苷酸的反式激活序列TAR RNA所形成的茎－环结构，稳定转录起始复合物，增强了RNA聚合酶Ⅱ转录反应的延续性，使转录过程顺利进行。目前的Tat抑制剂筛选方法主要基于Tat对LTR的转录增强活性特点。筛选方法如下。
①凝胶电泳检测法：加入Tat蛋白以及待检测药物，体外转录完成后提取转录产物，凝胶电泳检测药物对转录反应的影响，从而评价药物对Tat－TAR相互作用的影响。
②GFP表达检测法：在培养的细胞中同时转入Tat表达质粒及LTR控制的GFP表达质粒，Tat蛋白在细胞中的表达将会促进GFP蛋白编码序列的转录，从而增加绿色荧光蛋白的表达。
Tat抑制剂可使GFP蛋白的表达维持在很低的水平。
（4）化合物对HIV调节蛋白Vif、Rev、Nef等功能影响的研究。
（三）基于携带报告基因的病毒和细胞的筛选方法
携带报告基因假病毒是一种更简便的检测HIV复制的工具，具有以下几个优点。
（1）假病毒只复制一个周期（通常是感染后3～5天进行检测），不能从宿主细胞中出芽进行增殖。
（2）由于检测的是假病毒进入细胞表达的报告基因而非病毒粒子本身产生的蛋白质，故而在检测中可排除接种病毒的干扰。
（3）相对于HIV抗原的检测，报告基因（如荧光素酶）的检测是非常灵敏及简便的。
（4）假病毒由于是复制缺陷型病毒粒子，不能进行二次感染，低毒安全。目前从假病毒携带的报告基因来看，主要有三类假病毒报告体系：①最常用的一类为携带荧光素酶或氯霉素乙酰转移酶报告基因的假病毒；②携带标记性基因如热稳定性抗原CD（下标24）、Thy－1、碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白等的假病毒；③携带稳定性的筛选标记如gpt基因的假病毒。由于假病毒只复制一个周期，报告基因的表达依赖于病毒复制周期早期步骤的那个，包括病毒粒子的进入、逆转录、整台和前病毒RNA的转录，而病毒复制周期的晚期步骤如病毒粒子的包装和出芽在报告基因的表达之后出现，所以检测假病毒报告基因的表达水平只涉及病毒复制的早期步骤。
目前应用最广泛的是衣壳蛋白突变的假病毒，主要有两种。一种是包含HIV衣壳蛋白的假病毒，另一种是HIV衣壳蛋白质粒被含双嗜性鼠淋巴病毒（AMLV）或水泡性口炎病毒（VSV）的衣壳蛋白质粒代替后包装成含有HIV不完整基因组RNA、HIV核心蛋白和其他病毒衣壳的嵌合病毒。可在不同时间段将药物加入到感染以上假病毒的细胞中，以药物作用的时间段来准确判断药物具体作用于病毒的逆转录、整合和前病毒RNA转录这些过程中的哪个阶段。举例说明假病毒的包装和检测方法。
1．材料
（1）质粒pNL－Luc－R－Env－或NL－Luc－R＋Env－：质粒包含HIV－1前病毒克隆pNL4．3的大部分基因组，荧光素酶基因Luc代替了HIV的nef基因，HIV的env基因发生了移码突变，R－为vpr基因发生了移码突变。pSV7d－En：质粒将HIV－1的外壳蛋白基因（如HXB2、JB、FL、ADA的env基因）插入质粒载体pSV7d。
（2）细胞系和培养基HOS或U87细胞的培养基为DMEM、10％FBS、1％青链霉素。悬浮细胞的培养基为RPMI、10％FBS、1％青链霉素，一般需加入嘌呤霉素（1μg／ml）来维持共受体分子的长期表达。
（3）试剂Ca（下标3）（PO（下标4））（下标2）转染试剂，感染试剂（如Polybrene）和荧光素酶检测试剂。
2．方法
（1）假病毒粒子的包装转染前一天，传293或293T细胞至10cm培养皿，细胞数为2×10（上标5）个／10ml DMEM／10％FBS。用pNL－Luc－R＋Env－和pSV7d－Env两个质粒共转293细胞，转染48h后收上清，用0．45μm的滤膜过滤细胞沉淀，分装于1ml小管内，－80℃保存，取少量检测p24蛋白含量或逆转录酶含量。
（2）假病毒感染HOS或U87细胞感染前一天，传HOS CD（下标4）或U87．CD（下标4）细胞至24孔板，5×10（上标3）个／孔／1ml DMEM／10％FBS。把培养基换成含假病毒（10ngp24）的0．5ml的DMEM／10％FBS，5～18h后更换含不同浓度梯度药物的新鲜培养基。转染后3天，用200μl细胞裂解液裂解细胞，离心取上清液，在荧光仪或液闪仪上用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶读值。计算药物抑制假病毒复制的EC（下标50）值。
（3）假病毒感染CEM细胞感染前一天，传CEM细胞至24孔板，3×10（上标5）个／孔／300μl RPMI－1640／10％FBS，同时加入假病毒（10ng p24），3～5h后加入含不同浓度梯度药物的培养基。转染后3天，用200μl细胞裂解液裂解细胞，离心取上清液，在荧光仪或液闪仪上用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶读值。计算药物抑制假病毒复制的EC（下标50）值。
（四）体外HIV耐药性的检测方法
HIV的耐药性指由于病毒药物作用的分子靶位发生了特定的基因突变，导致病毒对药物的敏感性下降。HIV耐药性的产生是病毒复制过程中基因的高频率突变与抗病毒药物的选择压力共同作用的结果。不同的耐药株有不同的宿主细胞，选择相同作用机制药物的耐药株与合适的宿主细胞对于实验尤为重要。为了测定化合物对HIV耐药株的活性，可选择HeLa－CD（下标4）pBK－LTR－lac克隆细胞作为指示细胞。
方法：将HeLa－CD（下标4）pBK－LTR－lac克隆细胞培养成单层后，加入HIV耐药株感染MT－2细胞和待测化合物，混合培养4天后，以X－gal染色观察计数蓝色蚀斑，计算抑制率。也可测定HIV抗原的表达：在MT－2细胞悬液中加入HIV耐药株，37℃、5％CO（下标2）培养箱孵育3h后，用Hanks液洗涤3次，完全培养基重悬细胞，将4×10（上标5）个／ml细胞100μl加到含不同浓度药物的96孔板中，第3天补加100μl培养基，收集第7天的培养上清。用5％的Trition X－100常温裂解上清30min后，进行p24抗原检测。注意：选择对应耐药株相同作用靶点的阳性药物时，根据诱导耐药株时药物的最终浓度提高药物初始浓度10～1000倍。
（五）抗艾滋病病毒药物动物体内药效实验
根据1990年Schellekens的论述，建立理想的AIDS动物模型应具备6个条件：实验病毒应为HIV本身，这种动物能感染HIV；动物体型要小，它的遗传、免疫、代谢等已研究得比较清楚；靶细胞应该是CD（下标4上标＋）淋巴细胞和巨噬细胞为主；靶器官应包括血液、淋巴组织和脑；传染方式应类似HIV；有一短暂的潜伏期即可致病，发病症状与AIDS相似。
目前HIV－1除黑猩猩易感外，尚无适宜的动物模型；与HIV－1类似的HIV－2和猴艾滋病毒（SIV）可感染恒河猴。非灵长类动物模型属于逆转录病毒慢病毒感染所致，人艾滋病病毒的形态及核苷酸序列与非灵长类的许多致病性慢病毒相关。其研究最多的是感染并使有蹄动物致病的病毒：绵羊肺腺瘤／脱髓鞘性脑白质炎病毒（MVV）、山羊关节炎／脑炎病毒（CAEV）、马传染性贫血病毒（EIAV）和新发现的牛免疫缺陷病毒（BIV）。
由于某些大动物的来源不易，在实际工作中使用不方便，费用较高等原因，小鼠作为感染性疾病研究的动物模型越来越受到各国学者的重视。但是，由于小鼠本身没有CD（下标4）受体，因而无法用于HIV－1的研究。近年来，重度联合免疫缺陷鼠上移植人体有关器官和组织建立嵌合体鼠模型取得较满意的效果。此外，转基因小鼠的建立也应用于AIDS研究。目前，主要有4种转基因鼠：①HIV－1的tat转基因小鼠，主要用于卡波氏肉瘤的病理研究；②LTR转基因鼠；③Nef转基因鼠；④HIV－1全序列前病毒DNA转基因小鼠。使小鼠用于HIV－1的研究和AIDS的抗病毒治疗以及疫苗效力等研究的动物模型有望成功。也可用HIV－1感染细胞移植于裸鼠，用鼠白血病病毒（MuLV）感染Balb／C小鼠，或用艾滋病病毒感染移植入人淋巴细胞、组织的T、B细胞缺陷的鼠（SCID）作用药效评价模型。以逆转录病毒鼠白血病病毒模型为例介绍药物评价的方法如下。
（1）逆转录病毒鼠白血病病毒Ra－MuLV，RVB－3（VL－505）株。感染鼠的脾保存于－70℃。
（2）动物Balb／C小鼠，雌性，六周龄，14～16g。
（3）阳性对照药物叠氮脱氧胸苷（AZT）。
（4）病毒毒力测定冻存的感染鼠脾10％悬液稀释10倍后腹腔注射于正常小鼠，每只0．3ml，设正常对照组，2周后称体重，杀剖取脾称重，计算脾指数（脾重／体重），取血液测定红细胞数、白细胞数、血色素。与正常小鼠比较，感染3周后脾重增加，脾指数增加，白细胞显著增高，红细胞、血色素明显下降，计算ID（下标50）。
（5）药物毒性实验在14～16g、6周Balb／C雌性小鼠体内测定药物剂型LD（下标50）、LD（下标0），按给药方案测定给药20天亚急性毒性LD（下标50）。
（6）抗病毒实验雌性Balb／C小鼠腹腔感染后4h，按给药方案给药20天，设正常对照、病毒感染对照及各给药组。20天后称体重，杀剖取脾称重，取血测白细胞数、红细胞数及血色素。与病毒对照组比较，计算保护百分率和统计学意义。
