（1）培养基pH的影响一般做pH影响实验时，用不同浓度盐酸或氢氧化钠将培养基的pH调整为5．0、7．0、9．0等或根据不同种类药物培养基pH范围缩小或扩大，使其适合该药物实验条件。配制成不同pH的培养基，按试管二倍稀释法，将药物稀释成所需系列浓度，分装于小试管中，每管10ml或20ml，实验细菌根据抗菌谱广度而定，一般应用有代表性临床分离细菌不少于2株，接种菌量10的5次方CFU／ml，每试管接种0．1ml，置37℃孵育过夜，观察结果，记录未见细菌生长实验管即为该药物pH的MIC，其他pH观察以此类推。通过pH影响的观察，了解该药物影响程度。
（2）细菌接种量的影响接种菌量对药物抗菌活性的影响也是评价新药的一部分。一般用MH肉汤培养基，试管二倍稀释法，将药物稀释成8～10个浓度，分装于小试管中。细菌培养液用磷酸盐缓冲液或肉汤培养基稀释成10的2次方～10的8次方CFU／ml，每试管分别接种0．1ml，置37℃温箱培养过夜，观察各实验管中未见细菌生长的接种量，即为该药物的MIC。
一般抗菌药物在接种菌量增至10的8次方CFU／ml时，其抗菌活性受到一定影响，其他较小接种量对药物抗菌活性影响不显著。
（3）血清对药物抗菌活性的影响一般用马血清或人血清，由于血清中含有各种抗体，需经过56℃灭活30min后使用。采用MH肉汤培养基，将灭活血清稀释成25％、50％、75％等不同血清浓度与不含血清的MH培养基对比。各血清浓度，分别分装于小试管中，每管10ml，接种菌量按上述10的5次方CFU／ml，每实验管接种0．1ml，置37℃培养过夜，观察结果同前，未见细菌生长的实验管即为该血清浓度的药物MIC。
（4）阳离子的影响有些阳离子，如Mg2＋与药物结合，可减弱药物的抗菌活性，影响药物抗菌活性主要与该类阳离子的浓度有关。常将氯化镁溶解后，用MH肉汤稀释成0．3～12mol／L，另设一列不加Mg2＋作为对照，各浓度分别取10ml分装于小试管中，每实验管接种10的5次方CFU／ml菌液0．1ml，置于37℃温箱中孵育过夜，观察不同阳离子浓度的细菌生长情况，未见细菌生长的试管为该药物最低抑菌浓度，与未加Mg2＋试管的MIC对比，分析Mg2＋影响药物抗荫活性的差别。
（二）体内抗菌实验
机体本身对细菌具有较强的抵抗力，一般细菌感染动物后，不易使动物致病，所以体内抗菌实验模型建立较为困难，特别是一些致病途径特殊的模型建立更为困难，动物实验感染模型一般分为为身感染模型和局部感染模型。
1．体内抗菌实验所选用的实验材料
（1）实验动物一般选用健康小鼠，在某些特殊动物感染模型中，需要用到其他动物，如家兔的脑膜炎、感染性角膜炎；大鼠的肾盂肾炎、皮肤的创伤感染；豚鼠的痢疾杆菌或结核杆菌等，此时往往还需观测特殊的病理改变，且有些感染往往自限而可恢复。在动物感染过程中，由于细菌毒力不够或动物对该菌不敏感，此时可采取多种措施，常用的方法是用3％～5％猪胃黏蛋白将细菌配成悬液然后腹腔注射，每只鼠0．5ml，也可于感染前给动物注射可的松或大量的环磷酰胺（50～100mg／kg），感染前4天及感染当天注射，以降低机体抵抗力，使动物发病。还可因特殊研究目的而采用切除双侧肾上腺、封闭网状内皮系统（RES）等措施。实验中，一般选用小鼠的体重为18～22g，每组至少10只，雌雄各半。家兔体重约为2－2．5kg，大鼠为200g左右，豚鼠为200～300g，每组6～8只。
（2）实验菌应选用临床分离的致病力较强的菌株。由于传代的原因，有时菌株毒力减弱，需反复感染动物，再从体内分离以提高菌株毒力。另外，也可通过加入某些保护剂如胃膜素或于酵母，以保护细菌免受动物体内巨噬细胞吞噬。总之，尽量达到感染菌量少就能使动物发病。实验菌一般可用体液培养基培养，若需加大接种量，可将体液培养物离心集菌或用固体培养基接种，刮取菌苔备用。用无菌的5％胃膜素或干酵母（用生理氯化钠溶液配制，121℃高压灭菌）作为稀释剂，将菌液按10倍稀释成不同的感染浓度，并进行计数。革兰阳性和阴性细菌全身感染小鼠一般于24～72h死亡，但观察期限应以两周为宜。结核菌感染小鼠通常于两周后方才死亡。
（3）药液的配制根据被测药物的理化特性加入适当的溶剂配成所需浓度。可溶性药物可用无菌生理氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液配制；少数难溶药物可加入少量溶剂（如乙醇、丙酮）助溶，但溶剂量不得超过5％；不溶于水的药物，需用步量聚山梨酸80、3％阿拉伯胶、2％～4％淀粉或0．25％加0．5％羧甲基纤维素钠溶液中的一种配成均匀的混悬液，但只能用于口服给药；注射给药的药液，配制后要采用适当的方法灭菌。
2．体内实验方法
体内抗菌实验法是采用感染致病菌的动物模型（即模拟临床细菌感染疾病）进行抗菌药物实验治疗或预防，对抗菌药效做定量的评价，主要以半数有效量（ED50）或半数保护量表示。体内抗菌实验获得的结果与同类抗菌药或具有相似作用的已知有效药物进行比较，并将实验药的ED50与LD50相比较求其治疗指数（TI），即TI＝LD50／ED50，为评价药物的有效性与安全性提供参考资料。
（1）全身感染模型主要有腹腔感染模型及静脉感染模型。
①腹腔感染模型
【方法】感染菌量的选择：常用动物为小鼠。将制备好的不同浓度新鲜菌液腹腔注射3～5只小鼠，每只0．5ml，观察小鼠死亡情况，一般选用感染后能引起小鼠100％死亡的菌悬液浓度即最小致死量（MLD）作为实验治疗时小鼠的感染量，如果需要也可选用2倍或2倍以上的MLD50。
实验治疗：将小鼠随机分为数组，每组10只，其中一组为感染不给药物对照组，同一批次实验时，设已知药物作阳性对照比较。每鼠腹腔注射0．5ml菌液，给药时间和次数根据药物在体内的特性而定，一般吸收好，半衰期长的药物，可一次给药，半衰期短者可给药2～3次，给药时间一般在感染后的即刻、6h、12h。某些药物特别是中药，由于抗菌作用弱，难于在体内达到有效作用浓度，且中药还常可能通过调动机体非特异性免疫系统而起效。故中药一般在感染前预先给药，连续给药至感染后数日才能显效。动物给药途径应与临床应用途径一致，但腹腔感染动物不宜进行腹腔注射给药。感染后，逐日观察动物反应情况，连续观察7天，记录动物死亡数。若实验需要，动物死亡后应立即解剖，预定观察时间已到，存活的动物也应将其处死，进行解剖观察脏器病变情况并取出定量脏器研匀进行细菌计数。
结果判断：一般可以生存率或死亡率，还可以脏器细菌学检查作为治疗指标。与对照组比较作统计处理，用Bliss法求出半数有效量（ED50）和95％可信限，中药可用存活或死亡的百分率差别的显著性测验以评价药物治疗是否有效。
【注意事项】感染菌株第一次实验治疗时应做扛菌计数，此后，每次实验时条件一致，不必做活菌计数，用分光光度计进行比浊度控制菌液浓度即可。
实验步骤每环节需无菌操作。
【评价】腹腔感染的实验治疗为国内外常用感染实验模型，方法简便，易操作，重复性好，可作为评价新药疗效的方法之一。
②静脉感染模型
【方法】感染菌量的选择：静脉感染模型常用小鼠，有时因实验需要也可用家兔。感染一般以死亡为指标。将新鲜培养的菌液稀释成适当浓度。于每鼠尾静脉注射0．2ml，细菌直接进入血液分布到全身器官，最后集中在肾脏内大量繁殖，形成大小不等的脓肿，引起肾组织广泛坏死，造成动物短期内死亡，所以静脉感染菌量不宜过大，否则动物很快死亡，一般控制在感染24h以后开始死亡。与腹腔感染样，需确定引起动物100％死亡的细菌感染浓度（MLD）作为实验治疗时的细菌感染量。
实验治疗：设几个药物剂量组，另设一组已知对照组及一组感染不给药对照组。给药途径与临床一致，但静脉注射感染动物不宜用静脉注射给药，可用其他注射途径如皮下注射给药。给药时间及天数根据药物研究要求决定，治疗结果应有80％～100％和20％～0％的存活动物剂量。然后逐日观察动物死亡情况，若需要可进行解剖，取出肾组织做活菌计数或肾组织病理检查。
结果判断：以动物死亡率，也可以肾组织活菌计数或肾组织病理组织检查作为治疗指标。与对照组比较作统计处理，用Bliss法求出半数有效量（ED50）和95％可信限，中药可用死亡的百分率差别的显著性检验以评价药物治疗是否有效。
【注意事项】静脉感染前，小鼠固定在铁丝罩或木盒内，使尾露在外面，将尾部洗净，擦干，使用碘酊和乙醇分别消毒尾部，用4号或5号针头刺入一侧静脉内注入菌液0．2ml。针头插入静脉内有困难时，可用乙醇或热水敷，静脉充血后，针头易插入。
【评价】静脉感染模型的应用较腹腔感染少，可作为新药深入研究时评价的指标之一。
（2）局部感染模型抗感染新药不断被发现，仅用全身感染实验模型不能满足新药评价要求，需要有与临床感染近似的局
①泌尿系统感染实验模型：临床上泌尿系统感染为常见和多发病，发病率高，病期长。实验室造成动物泌尿系统感染可将菌液注入静脉后，细菌汇集肾脏引起炎症过程；另一种菌液直接注入膀胱内造成上行性肾组织感染；后者实验室常采用局部感染方法，其中一种方法小鼠麻醉，以手术操作打开腹腔后，将感染菌液，用注射器直接注入膀胱内，另一种目前常用的方法，小鼠经麻醉后，用注射器钝针头从尿道口插入膀胱内注入感染菌液，引起上行性感染。
a．腹腔内膀胱上行性肾感染
【方法】感染菌液制备：用接种环刮取菌苔少许，接种于肉汤培养基中，置37℃温箱内孵育16～18h作为感染菌液。
实验准备：手术器械（剪刀、手术刀、镊子、缝线、缝针、手套），0．25ml注射器，5号或6号针头，解剖板，碘酊，75％乙醇，17～20g小白鼠，实验前一日禁喂水。
预试感染：实验时将小鼠用乙醚吸入麻醉或用戊巴比妥钠溶液（30mg／kg）腹腔或皮下注射麻醉，在鼠下腹部，用手加压，使膀胱内残留尿溢出排空；麻醉鼠仰卧于解剖板上，用剪刀或刀片将麻醉鼠下腹部长毛剪短或剔除后，用碘酊和75％乙醇分别消毒；无菌操作下，在下腹膀胱位置，用刀切开腹壁0．6～1．0cm长的切口，暴露膀胱，手持镊子固定膀胱，用注射器吸取感染菌液0．02，0．03或0．04ml，分别注入膀胱内，小鼠感染后，进行腹壁缝合和缝合口消毒，小鼠放回笼内，继续禁喂水4h，有条件的实验室，用自制小铁夹夹住尿道口两侧皮肤，防止膀胱内感染菌液流出。
预试感染结果：小鼠感染后第4日处死，无菌操作条件下，取出双侧肾脏，一只肾研磨成匀浆做活菌计算或肾纵切成两剖面，将剖面盖印于平皿琼脂培养基上，经37℃培养16～18h，检查肾脏活菌数量，另一只肾做病理组织切片镜检，观察肾脏感染后损伤程度。按上述感染菌液有一定活菌数和肾炎症损害即可作本实验感染菌量。
预试治疗：按上述选定感染菌液量进行小鼠膀胱感染，感染后，根据研究药物设3～4剂量组和感染不给药对照组，一般第一次给药时间为感染后4h，第2和第3日为1～2次／日。感染后第4日，按剂量组分别处死小鼠，解剖取出两侧肾脏，置无菌平皿内，按预试感染项，将肾纵切成剖面或研磨成匀浆进行活菌计数（病理组织切片根据药物研究而定）。实验结果根据药物剂量与细菌清除率作为实验治疗参考。
实验治疗：根据预试治疗结果药物设计4～6剂量组（按mg／kg计量），与已知药物对照同时进行感染治疗实验。给药后第4日处死动物，按预试治疗，解剖取出双侧肾脏，采用肾剖面盖印培养或肾研磨成匀浆进行活菌计数法，检查各药物剂量组的活菌数的清除细菌数量，计算ED50或治疗指数。
【方法应用】膀胱细菌上行性肾感染可应用抗生素或抗菌药物实验治疗，例如抗生素89－07对大肠杆菌26的小鼠膀胱上行性肾感染实验治疗，给药剂量为10，5，1和0．2mg／kg皮下注射，每剂量鼠10只，第1日感染后4h给药一次，第2和第3只是2次／日，并同时与庆大霉素（GM）、丁胺卡那霉素（AMK）和妥布霉素（TOB）进行比较，给药后第4日处死动物，取出肾脏，纵切成剖面，剖面盖印于平皿琼脂培基上，经培养后，接剂量统计活菌数，作为清除细菌数的疗效，GM、AMK和TOB按相同方法统计疗效。
【注意事项】感染菌株必须选择致病力强的临床分离菌株。
腹腔内细菌上行性肾感染的各环节均需进行无菌操作。
感染菌液不必稀释，感染后以肾脏有炎症反应和活菌数为准。
【评价】小鼠腹腔内膀胱上行性肾感染的方法较复杂，可作为新药深入研究方法之一，而此方法与临床上行性尿路感染一致。
b．膀胱插管法上行性肾感染：本方法优点是不用手术切开腹壁和暴露膀胱，而用插管通过尿道口插入膀胱内，将菌液直接注入膀胱内引起上行性肾感染。此方法简便易行，无需特殊设备即能达到感染目的。
【方法】
实验准备：带齿小镊子，0．25ml注射器，5号、6号钝针头（作膀胱插管用），解剖板，碘酒，75％乙醇。17～20g雌小鼠，禁喂水24h。
实验步骤：本实验除不通过腹腔内膀胱感染外，其他基本相似。小鼠经乙醚吸人或戊巴比妥钠麻醉下，仰卧于解剖板上，尿道口周围用碘酒和乙醇分别消毒。
膀胱插管：用带齿小镊子将尿道口侧皮肤呈45°～60°角提上，然后将0．25ml注射器配各5号钝针头插入尿道内，缓慢向内推进，直至针座接触尿道口为止，证明针头已插入膀胱内，此时注入适量菌液，感染后防止菌液溢出尿道口，可用小铁皮夹夹住尿道口皮肤2～4h，并继续禁喂水4h。
实验治疗：小鼠感染后，根据药物实验要求，设计合适剂量组，疗程与已知药物同时比较。结果判断与腹腔内膀胱感染相一致。
【方法应用】本方法可应用于新抗生素或抗菌药物深入研究的实验治疗的疗效评价。
【注意事项】由于本方法用插管从尿道口插入膀胱内，小鼠麻醉深度适中，能使膀胱括约肌松弛，使插管能顺利进人膀胱内；插管进入尿道宜缓慢，呈45°～60°向前推进，以免损伤尿道，推进有阻力时，稍改变方向，即能顺利进入膀胱内。
