一、抗微生物药物概述
抗菌药物的药理研究方法有很多，概括起来主要包括体外实验和体内实验（整体动物实验法）两种。通常我们在体外对药物进行测试后，有效的药物再进行体内实验，如果体内实验再次证实此药有效的话，才能推荐应用到临床。
二、抗微生
（一）体外抗菌实验
体外抗菌实验主要用于筛选抗苗药物或测定细菌对药物的敏感性，所以也称为药敏实验，常用最低抑菌浓度（MIC）表示，是指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。其主要在玻皿的培养基中进行，方便简便，用药量少，实验条件容易控制，需时短，药物也可以定量。但本法具有一定的局限性，抗菌作用易受到多种因素的干扰，如培养基的组成、温度、PH及所用的菌种、苗量等各个因素。因而体外筛选阳性药物，进入体内是否有效，还必须通过动物体内实验治疗加以肯定。
1．体外抗菌实验所选用的实验材料
（1）细菌所试细菌应与受试药抗菌谱一致并包括主要致病菌。实验菌一般应包括标准菌株及临床分离的菌株。标准菌株可从中国食品药品检定研究院、各地生物制品研究所或防疫站申请得到。临床新分离的菌株须经形态、生化及血清学等方面鉴定。对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不少于1000株。其他类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200～500株。
实验用菌株应注意菌株纯度，不得有杂菌污染。不宜用传代多次的菌种，最好从保藏的菌种中重新活化。实验菌必须生长新鲜旺盛，培养时间应控制在18～24h，如特殊菌种可延长培养时间。流感杆菌、淋球菌于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养24h，厌氧菌置于厌氧环境中培养48h。实验菌接种量的多少应选用适当方法进行计数。
体外筛选实验所选产酶耐药菌株应具有广泛的地域代表性。
（2）培养基培养基（culture medium）是微生物生长、分离鉴别的营养物质基础。目前，除麻风杆菌、梅素螺旋体等少数菌种外，绝大多数细菌都可以在人工培养基上生长，细菌培养必须满足不同细菌的生长条件。
①培养基的分类：按培养基用途可以分为营养培养基，增菌运进培养基，选择鉴别培养基和特殊培养基四种。
营养培养基：含微生物生长繁殖所需基本物质的培养基。常用以牛肉浸粉、蛋白胨、氯化钠为基础，也可增加所需的其他营养物质，如血液等。琼脂是培养基中常用的凝固剂，以支撑细菌的生长形态形成菌落，它对细菌无营养价值。
增菌运送培养基：将可疑标本接种于运送培养基中。增菌培养基为液体，是扩大培养的手段，也是细菌生化反应的主要培养方法。
选择鉴别培养基：在培养基中加入指示剂或化学物质，抑制某些细菌生长而有助于需要的细菌生长，或通过指示剂颜色变化分离鉴别细菌。
特殊培养基：包括厌氧培养基及其他（抗生素效价测定和药敏实验）培养基。
②按物理性状可分为液体、半固体及固体3种。
液体培养基：将营养物质溶解于液体中，调整pH灭菌后即为液体培养基。常用于细菌增菌或观察细菌的生化反应。有各种肉汤培养基。
固体培养基：液体培养其中加入13～15g／L的琼脂，溶化后凝固成固体培养基。制成平皿，用于分离细菌培养、活菌计数、选择培养、药敏实验。固体培养基可在试管中制成斜而用于菌种传代和短期保存
半固体培养基：液体培养基加入2～5g／L的琼脂。主要用于细菌动力观察和菌种保存。
③常用的培养基：常用的培养基有：MH培莽基、Mueller－Hinton琼脂、Wilkins－Chalgren－培养基、胰酶解酪蛋白大豆肉汤等。
MH（Mueller－Hinton）培养基
近年来，MH培养基为各种体外实验所广泛采用。因该培养基可提供大多数微生物接近于生理状态的阳离子浓度（约每升含Ca2＋50mg，Mg2＋25mg）。
牛肉粉300g
水解酪蛋白17.5g
可溶淀粉1.5g
制备方法：将牛肉出脂肪、肌腱后绞碎，加蒸馏水1000ml，先制成肉浸汤。于1000ml肉浸汤内，加入上述成分，调整pH为7．4，于121℃高压灭菌1．5min备用。
用途：用于需氧菌或兼性厌氧菌药敏实验液体培养基稀释法。
Mueller—Hinton琼脂(MHA)
牛肉粉300g
琼脂17g
药理学实验方法
水解酪蛋白17.5g
可溶性淀粉1.5g
蒸馏水1000ml
制备方法：按MH肉汤法先制成MH肉汤，调整pH为7．4，加入琼脂加热溶化后分装试管或烧瓶，于21℃高压灭菌15min备用。
用途：用于需氧菌和兼性厌氧菌药敏实验琼脂稀释法及扩散法。
说明：本培养基加入5％人血或羊血，可用于链球菌药敏实验。如将MHA溶化后，待冷至80％，加入羊血（5％～10％），于10min后倾注平板，可用于嗜血杆菌的药敏实验。
Wilkins—Chalgren培养基
胰酶消化酪蛋白10g丙酮酸钠1g
胰酶消化明胶的胶溶物10g氯化血红素5mg
酵母浸膏5g维生素K1 0.5mg
葡萄糖1g琼脂15g
氯化钠5g蒸馏水1000ml
L—精氨酸(无碱)1g
制备方法：将上述前10种成分加入蒸馏水，加热溶解，调整pH到7．0～7．2，分装后于121℃高压灭菌15min。
用途：用于厌氧菌药敏实验。
胰酶解酪蛋白大豆肉汤
胰酶消化酪蛋白17g磷酸氢二钾2．5g
木瓜酶解植胨(大豆酶解物)3g葡萄糖2.5g
氯化钠5g蒸馏水1000ml
制备方法：将上述前5种成分溶于水，调整pH为7．3，分装试管或烧瓶，高压灭菌121℃15min，备用。
用途：用于药敏实验的试管稀释法。由于具有优良刺激细菌生长特性而适用于血液培养，此时应在灭菌前再加入0．03％～0．05％SPS，还可以在此培养基中加入少量琼脂用于梭菌属的培养。
实验用培养其可根据实验菌生长的营养需求进行选择。所用的培养其应能使实验菌生长良好。对营养要求不高的细菌如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、变形杆菌等，可采用MH培养基或营养肉汤培养基。抑菌实验选用MH培养基更为合适，因为该培养基可提供大多数细菌接近于生理状态的阳离子浓度。营养要求高的细菌培养基中需添加特殊营养剂，如链球菌、脑膜炎奈瑟菌的培养基中需加5％羊血或兔血；流感杆菌需用巧克力培养基或营养肉汤加5％羊血；淋球菌可用哥伦比亚培养基；厌氧菌用含维生素K（0．1ug／ml）和氯化血红素（5ug／ml）的布氏肉汤；对一些厌氧条件要求不高的厌氧菌及一些能引起溶血的，需血培养的实验菌可采用硫乙醇酸盐培养基，此时应注意不要破坏该培养基的厌氧环境。对澄明度较差影响抑菌实验结果判断的样品可选用葡萄糖粉红培养基，在此培养基中，细菌能发酵葡萄糖产酸，使酚红由红色变为黄色便于观察结果。
④培养基的制备：不同培养基制备的程序不尽相同，但配制一般培养基的主要程序为：调配、溶化、矫正pH、澄清过滤、分装、高压灭菌剂检定等步骤。
调配：按培养基处方准确称取各种成分，混悬于蒸馏水或去离子水中。
溶化：将各种成分混匀于水中，最好以流通蒸汽溶化半小时，如在电炉上溶化时应注意随时搅拌，特别是含有琼脂成分的更应该注意防止烧焦或外溢。溶化完毕，应注意补足失去的水分。
制备大量培养基时，除中性硬质玻璃容器外，还可以使用不锈钢锅、搪瓷桶等加热溶解，但不可用铜或铁锅，以免金属离子进入培养基中，影响培养基酸碱度，最终影响细菌的生长。
矫正pH：测定培养基pH可选用比色法和pH计法，精密pH试纸也可测定，方法简便，但不够准确。比色法中常用的指示剂有酚红指示剂和溴麝香草酚蓝指示剂，酚红的变色范围是pH 6．8～8．4，酸性时为黄色，碱性时为粉红色，中性为淡红色；溴麝香草酚蓝的变色范围是pH 6．0～7．6，酸性时为黄色，碱性时为蓝色，中性为黄绿色。一般培养基需矫正pH至7．4～7．6，此外亦有需要酸性或碱性的培养基。
矫正pH可选用0．1mol／L氢氧化钠或0．1mol／L盐酸溶液，加入时要精确缓慢，每加1滴后要充分混匀。培养基在高压灭菌后pH会有所变化，通常，用氯氧化钠调节时，灭菌后会下降0．1～0．2；用碳酸氢钠调节时，灭菌后会上升0．1左右。
分装：根据需要将培养基分装于不同的三角烧瓶、试管等。分装量小易超过容器的2／3，以免灭菌时外溢。
高压灭菌：不同成分、性质的培养基，可采用不同的灭菌方式。高压蒸汽灭菌是其中之，高压灭菌的温度与时间随培养基的种类及数量的不同有所差异，一般培养基121℃高压灭菌30min即可。含糖的培养基116℃高压灭菌15min，以免糖类被破坏。
（3）样品供试药物用灭菌注射用水，或磷酸盐缓冲液，或适宜的溶剂溶解，并稀释至所需浓度。少数难溶的药物，可用适宜的助溶剂溶解，再用稀释剂稀释至所需浓度。液体样品浓度若太稀，需要先浓缩。中草药或有些生药原粉的样品，应先进行提取，再浓缩至所需浓度，若为煎剂则应注意其无机离子浓度，pH，干扰物质和鞣质，蛋白质等均对结果产生大的影响。含菌样品需先除菌方可进行抑苗实验，尽量采用薄膜过滤法除菌，不易过滤的样品可采用煮沸或108℃灭菌5～10min，总之，选用灭菌方法时要以不破坏药物成分为前提。另外，样品在培养期间不应变质。
2．体外抗菌实验方法
药物的体外抑菌实验是常用抗菌实验方法，其中最常用的方法为扩散法和稀释法。
（1）扩散法
①纸片法、管碟法及打孔法
【原理】在不同的培养其平皿内，预先接种各种实验菌，然后在此平皿内贴受试药浸润过的无菌滤纸片；或在平皿内置入装有受试药液的杯管；或直接在培养基上打孔灌入受试药液，经一段时间的培养，观察纸片、杯管或小孔周围细菌生长情况。若有抑菌作用，则可见其周围出现抑菌圈，以抑菌圈的大小判断受试药物的抗菌作用，即抑菌圈越大，其抗菌作用越强。
【方法】培养基：生长较快的需氧和兼性厌氧菌采用Mueller－Hinton琼脂（MHA），pH7．2。倾注平皿应在水平台上进行。90mm内径的平皿倾注25ml，140mm内径的平皿倾注60ml使琼脂厚度为（4±1）mm。MH琼脂平皿用塑料袋密封后可在4℃冰箱内保存1周。用粪链球菌ATCC 29212或33186来测定M－H琼脂是否适合做磺胺类实验。临用前置35℃孵育30min，使其表面干燥。对生长条件要求较高的细菌，如链球菌属和肠球菌属细菌需要在MH琼脂中加入5％脱纤维羊血（或马血、兔血）。嗜血杆菌属细菌需要补充1％血红蛋白和1％V、X因子复合物，检测菌为甲氧西林耐药性葡萄球菌（MRSA）时应在MH琼脂中加入20g／L氯化钠，检测菌为淋病奈瑟菌时应使用含1％血红蛋白和1％V、X因子复合物的GC琼脂，检测菌为厌氧菌时应使用W－C血平皿。
接种菌液的制备：挑取已分纯的菌落4～5个制备菌悬液。制备蘸液的方法有：生长法：挑选琼脂平皿上，形态相同的菌落移种于MH液体培养基中，置35℃水浴箱中孵育4h，校正浊度至0．5麦氏标准。直接调制菌悬液法：用接种环挑取生长在无选择性琼脂平皿上新鲜菌落，悬浮于生理氯化钠溶液中，振荡混匀后与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸为背景，调整浊度至0．5麦氏标准。
菌液接种：制备好的接种菌被必须在15min内使用。用灭菌的棉拭子蘸取菌液，在管壁内轻轻旋转挤压几次，去掉过多的菌液。用拭子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平皿旋转60°，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。也可在MH琼脂表面滴加300ul菌液，用无菌的“L”形接种棒均匀涂布。室温放置3～5min。
以下为含药纸片及平皿的制各方法。
纸片法：药物纸片可以购买直径约为6．00～6．35mm，吸水量20ml的专用药敏纸片，也可自制（如选用吸水力较强而质地均匀的滤纸，用打孔器制成直径6mm的圆片，置洁净干燥试管内，120℃干热灭菌2h），用前需做吸水量测试及质量鉴定。之后用逐片加样或浸泡的方法使每片的含药量随药物不同有所差异，纸片冷冻干燥后密封，置－20℃保存备用。
贴含药纸片：需待平皿上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片，用无菌镊子取纸片一张，贴在琼脂平皿表面，用镊子压一下，使其贴平，纸片一旦贴下就不可再章起。每张纸片间距不少于4mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。直径为90mm的平皿最好贴6张。贴上纸片后，需在15min内翻转琼脂平皿后进行培养。
管碟法：取已接种实验苗的平皿，在每平皿中以等距离均匀安置滴装有受试药液的不锈钢小杯［内径（6．0±0．1）mm，高（10．0±0．1）mm，外径（8．0±0．1）mm］4～6个，用无菌陶瓦圆盖覆盖备用。
打孔法：取已接种实验菌的平皿，用直径6～12mm无菌金属打孔器在每平皿内均匀打洞4～6个，除去洞内琼脂，灌入受试药液，用无菌陶瓦圆盖覆盖备用。
孵育及结果判断：准备完毕后，将平皿放入35～37℃孵箱内培养16～24h，取出后观察结果，若受试药物有抗菌作用，则出现无菌生长的抑菌圈。用精确度为1／10mm的游标卡尺测量抑菌圈直径，抑菌圈的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，也可用半自动或自动抑菌圈读取仅读取数据。根据抑菌圈大小，制定标准，判断该受试药物抑菌作用的强弱。
②挖沟法和纸条法
【原理】在不同细菌的培养基中央，挖一条沟（或贴上用受试药物浸润过的滤纸条），沟内灌入受试药物，沟旁（或纸条旁）种入水同的受试菌种，经一定时间培养，观察沟旁（或纸条旁）细菌生长情况，以抑制距离的长短判断受试药物的抗菌作用强弱。
【方法】培养基及接种菌液的制备：同纸片法。
含药平皿的制备：肉汤琼脂培养基融化后，倒入灭菌的平皿内4±1mm厚，待其凝固，以无菌切刀在培养基中央切除宽1cm，长5～6cm条块，深度到底。即见平皿中央出现一条整齐的长沟，将受试药物稀释成适当浓度的溶液，灌入沟内，以药液不外溢为度。或用被受试药物浸润过的滤纸条代替。
菌液接种：将培养的实验接种菌液用灭菌接种环将菌分别在沟或纸条的两侧（垂直方向）作划线接种。
