（1）定磷法由于核酸中都含有磷酸基，且纯的核酸含磷元素的量为9．5％左右，故可通过测定磷的量来测定核酸含量。其原理是：先将核酸样品用强酸（如浓硫酸、过氯酸等）
消化成无机磷酸；然后，磷酸与定磷试剂中的钼酸铵反应生成磷钼酸铵，它在还原剂作用下被还原成蓝色的钼蓝复合物；最后在650～660nm下比色测定，得出总含磷量（核酸磷加上无机磷），再减去无机磷（即不经消化直接测定）的量即为核酸磷的真实含量，此值乘以系数10．5（即100／9．5）即为核酸含量。
定磷法的适用范围为10～100μg核酸。
（2）定糖法核酸分子含有核糖或脱氧核糖，这两种糖具有特殊的呈色反应，据此可进行核酸的定量测定。
①RNA在浓盐酸或浓硫酸作用下，受热发生降解，生成的核糖进而脱水转化成糠醛，糠醛与3，5二羟甲苯（苔黑酚）反应生成绿色物质，最后在670～680nm下比色测定。
有关反应为：
②DNADNA受热酸解释放出脱氧核糖，后者在浓硫酸或冰醋酸存在下，可与二苯胺反应生成蓝色物质，在1595～620nrn波长下进行比色测定。化学反应式为：DNA或脱氧糖＋NH浓硫酸蓝色物质。
③定糖法的测定范围苔黑酚法为20～25μg RNA，二苯胺法为40～400μgDNA。在此范围内光吸收与核酸浓度成正比。
核酸纯度测定可用紫外吸收法和凝胶电泳法。
（1）紫外吸收法测核酸纯度通常利用测定260nm与280mn光吸收比值来确定。纯DNA的A260／A280为1．8，纯RNA的A260／A280为2．0。因此，在纯化DNA时，通常用A260／280=1．8～2．0作为纯度标准，若大于此值，表示有RNA污染；若小于此值，则有蛋白质或酚等的污染。
（2）凝胶电泳法鉴定DNA纯度凝胶电泳能够按相对分子质量的大小来分离各组分，这不仅用于蛋白质的分离、制备和鉴定，也广泛用于核酸的鉴定、分离及制备。在核酸研究中用得较多的是琼脂糖凝胶电泳，它是目前分离纯化和鉴定核酸（特别是DNA）的标准方法。琼脂糖凝胶电泳操作简单迅速，用低浓度的溴化乙锭（EB）染色，就可直接在紫外灯下观察、鉴定和分析DNA，并进而制备、测定DNA。
DNA在琼脂糖凝胶中的泳动率（迁移率）取决于下面几个因素：DNA的分子大小、琼脂糖的浓度、DNA的构象、电流强度等。在凝胶电泳中，DNA相对分子质量的对数与它的泳动率成反比。因此，如果DNA样品不纯，或含有RNA，或含有小相对分子质量DNA，则在电泳过程中可明显区别开来，呈现出非单一的谱带；如果DNA样品很纯，电泳后只呈现出一条区带。
不同来源的DNA分子放在一起加热变性，然后慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间有互补的序列或部分互补的序列，则复性时会形成“杂交分子”。在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程称分子杂交。核酸的杂交在分子生物学和分子遗传学的研究中应用极为广泛。如将已知基因的DNA制成具有同位素标记的DNA片段——DNA探针（DNA probe），用其去检测未知DNA分子。
杂交技术较广泛的应用是将样品DNA切割成大小不等的片段，经凝胶电泳分离后用杂交技术寻找与探针互补的DNA片段。由于凝胶机械强度差，Southern提出一种方法，将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再进行杂交，称Southern印记法或Southern杂交技术。随后，Alwlnel等提出将电泳分离后的变性RNA吸附、印迹到纤维膜上再进行分子杂交的技术，被称为Northern印迹法或Northern杂交。Southern杂交和Nonhem杂交广泛用于研究基因变异，基因重排，DNA多态性分析和疾病诊断。
（第三节 ）DNA的生物合成
现代生物学已充分证明，核酸是生物遗传的物质基础。除少数RNA病毒外，几乎所有的生物均以DNA为遗传信息的载体。生物的遗传信息以密码的形式贮存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传给子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA；再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸序列，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代极其相似的遗传特征。
DNA复制（replication）是指以亲代DNA分子的双链为模板，按照碱基配对的原则，合成出与亲代DNA分子相同的两个双链DNA分子的过程。而转录（transcription）则是以DNA分子中的一条链为模板，按照碱基配对原则，合成出一条与模板DNA链互补的RNA分子的过程。翻译（translation）（或称转译）是以mRNA为模板，按照三个核苷酸碱基（三联体密码子）决定一个氨基酸的原则，把mRNA上的遗传信息转换成蛋白质分子中特定的氨基酸序列的过程。
20世纪70年代，人们发现RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA。
其中，逆病毒（retrovirus）在宿主细胞中能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录（reverse transcnption）。
遗传信息的流动过程可用分子生物学的中心法则来概括，如图5—9所示。
中心法则奠定了遗传、免疫、进化系统在分子水平上的理论基础。
自从1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型以来，对核酸的结构与功能的探索已成为生命科学中最重要、最活跃的研究领域。尤其是近20年，对核酸的生物合成及其调控机理的研究日渐深RNA复制人，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等重要的生命现象有了更加深刻的认识，极大地推动了相关领域的研究工作；而且以这方面的理论和技术为基础，建立并发展了基因工程。这些研究和技术的不断发展，将给人类的生产和生活带来深刻的变化。
一、DNA的复制方式
作为遗传物质的DNA不仅要贮存大量的遗传信息，而且还必须能够准确地自我复制，并有可能在不损伤亲代主要信息的前提下，发生少量的变异。DNA严格遵循碱基配对原则，形成互补的双链结构，这对于保持遗传信息的稳定性和实现复制的准确性具有十分重要的意义。
（1）半保留复制早在1953年，Watson和CrIck在DNA双螺旋结构的基础上提出了DNA的半保留复制假说。他们推测复制时DNA的两条链分开，然后用碱基配对方式按照单链DNA的核苷酸顺序合成新链，以组成新DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的。这种复制方式称为半保留复制，后来的许多实验都证实了DNA的这种半保留复制（图5-10）。
双链DNA的复制模型
（2）DNA复制的分子机制按照watsOilcrjck假说，DNA的两条链的方向相反，所以复制时，如新生DNA的一条链从5"→3"端合成，则另一条链必须从3"→5"端延伸。可是，迄今发现的DNA聚合酶都只能催化DNA链从5"→3"端延长。
DNA的半不连续复制示意
1968年冈崎等用3H脱氧胸苷掺人噬菌体感染的大肠杆菌，然后分离经过标记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段，接着出现较大的分子。一般把这些DNA片段称为冈崎片段。进一步的研究证明，冈崎片段在细菌和真核细胞中普遍存在。细菌的冈崎片段较长，有1000～2000个核苷酸。
冈崎的重要发现以及后来许多其他人的研究成果，使人们认识到DNA的半不连续复制过程：新DNA的一条链是按5"→3"方向连续合成的，称为“前导链”；另一条链的合成则是不连续的，即先按5"→3"方向合成若干短片段（冈崎片段），再通过酶的作用将这些短片段连在一起构成第二条子链称为后随链。DNA的半不连续复制见图5-11。
二、有关DNA复制的酶
DNA的复制是一个十分复杂而精确的过程，涉及许多蛋白质因子和酶。由于DNA是由脱氧核苷酸聚合而成的，所以与DNA复制有关的酶，包括DNA聚合酶、一些解除DNA高级结构的酶和蛋白质因子。
1.DNA聚合酶——DNA复制的基本酶
DNA聚合酶（DNA polymerase）是催化体内以脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物合成DNA的一类酶，不同生物体内DNA聚合酶的种类不同。
（1）原核细胞DNA聚合酶
①pol.·Ⅰ1956年A．Kornberg等在大肠杆菌中发现了第一个DNA聚合酶（pol·Ⅰ），该酶是一个Mr=109000的单链蛋白，它所催化的DNA合成反应是以DNA作为模板（termplate）的，故又被称为依赖DNA的DNA聚合酶。实验证明，pol·Ⅰ催化DNA合成反应所需要的条件有：单链DNA作为模板，四种脱氧核苷三磷酸作为底物，与模板DNA链互补的一段具有3"-OH末端的低聚脱氧核苷酸为引物，另外需要M2＋或Mn2＋。聚合反应按5"→3"的方向进行，产物是与模板DNA互补的DNA链。
pol·Ⅰ是一种多功能酶，除了具有5"→3"聚合催化功能外，还具有外切核酸酶的活性，即同时具有3"→5"外切酶活性和5"→3"聚合酶活性。pol·Ⅰ的3"→5"外切酶活性与5"→3"的聚合酶活性作用正好相反，当存在与模板错配的核苷酸时，这种活性就起作用，切除错配的核苷酸，然后再继续进行聚合反应，从而起到了校正功能（正确配对的底物能抑制3"→5"的外切酶活性）。pol·Ⅰ的5"→3"外切酶活性主要用于切除引物、变异核苷酸，故又起到了修复功能。poI·Ⅰ的各种酶活性都是以聚合酶活性为中心的。
②pol·Ⅱ、pol·Ⅲ20世纪70年代初，从大肠杆菌中先后又分离出两种DNA聚合酶，分别命名为DNA聚合酶Ⅱ和聚合酶Ⅲ。
pol·Ⅱ和pol·Ⅲ都具有5"→3"的DNA聚合酶活性，催化反应所需要的条件也与pol·I基本相同，只是所需引物为RNA。在外切酶活性方面，pol·Ⅱ只有3"→5"的外切酶活性，而无5"→3"的外切酶活性。pol·Ⅲ具有两个方面的外切酶活性，是复制时发挥主要作用的酶。
（2）真核细胞DNA聚合酶真核生物中至少拥有五种DNA聚合酶，分别命名为α、β、γ、δ和ε。它们能在5"→3"方向上聚合DNA链，但各酶的具体功能不尽相同。
真核细胞中与DNA复制相关的主要聚合酶是DNA pol·α和DNA pol·δ，它们在DNA复制中可能是互相协作的，poI·α催化前导链合成，pol·α催化后续链的合成。pol·δ还具有3"→5"外切酶的校正功能，并具有解旋酶的作用。
DNA pol·γ是首先在真核细胞的线粒体中发现的，它催化相关DNA的复制。pol·ε在真核细胞内主要与修复有关。pol·β可能与pol·α和poI·ε在DNA修复中共同发挥作用。
2.DNA连接酶——连接DNA片段的酶DNA连接酶催化一个DNA链的5"-磷酸根与另一个DNA链的3"-羟基形成磷酸二酯键，但是这两个链必须与同一个互补链结合，而且两个链必须是相邻的，反应要供给能量。
3.引物酶和引发体
各种DNA复制开始时都需要有引物，在引物基础上才能进行DNA的聚合反应。因为所有的DNA聚合酶都只有按照模板链的指令在引物3"-OH端延伸新链的功能，没有从头开始合成的活力。通常，引物是在复制前先行合成的一小段RNA，它的合成是RNA聚合酶与复制起点结合后，以DNA为模板而催化合成的引物，酶的相对分子质量为60000，它必须与另外几种辅助蛋白质组装成引发体，才有合成引物的活性。
4.解链酶
解链酶又称解旋酶。DNA在复制和修复时都必须解开双链，使其成为单链，提供单链DNA模板，DNA解旋酶就是催化DNA双螺旋解链的酶。解旋酶是借助ATP的能量来解开DNA双链的。原核细胞中，解旋酶与单链DNA的亲和力强，并能沿模板DNA 5"→3"方向由单链向双链部分移动。各种解旋酶与引物酶等常构成复合体，在DNA复制时有协同作用，从而解开双螺旋。
5.旋转酶
旋转酶即拓扑异构酶，其作用是消除DNA的超螺旋，旋转酶根据作用于DNA的方式不同而分为两类：旋转酶Ⅰ和旋转酶Ⅱ。
6.单链结合蛋白
单链结合蛋白（SSB）又称为螺旋去稳定蛋白，是一种能与单链DNA结合的特异蛋白。
当它与经解链的单股DNA链结合后，两条DNA链就不能再形成双螺旋，保证了单链区的稳定，让单链能够作为DNA合成的模板。
单链DNA与SSB结合后，既可保护自身免遭核酸酶的降解，又可防止解链的DNA再度自发生成螺旋，使单链DNA保持伸展状态，并使碱基暴露，以便作为合成新链的模板。
