10.5转基因植物中外源基因的沉默
研究表明，外源基因在转基因植物中有的能正常表达，有的表达量很低，甚至不表达，这种基因失活的现象被称为基因沉默（gene silencing）。研究表明，转基因诱导的基因沉默是植物遗传转化过程中普遍发生的，在谷类中，有超过50%的转基因植物在世代传递过程中发生基因沉默。
植物遗传转化中外源基因的整合具有很大的随机性，外源基因的沉默也表现出多种多样的形式。除了基因的拷贝数外，在受体植物染色体上的整合位点与外源基因的沉默也密切相关，并且基因沉默也不总是发生在转化体的每一个发育时期、每一个细胞中。例如在转基因豌豆中chs 基因沉默时，表现为各种各样的花色类型。根据对现有转基因植物的分析和研究，外源基因沉默一般可归为两种类型：①转录水平上的基因沉默（ tranional gene silencing，TGS），由于某种原因造成启动子失活，从而不能正常合成mRNA，使基因失活；②转录后水平上的基因沉默（ post tranional gene silencing，PTGS），则表现为启动子是活跃的，但mRNAs 被降解而不能积累。
10.5.1转录水平上的外源基因沉默（TGS）
转录水平上的外源基因沉默与位置效应、高度甲基化及启动子的失活相关。
1.位置效应
位置效应（position effect）是指基因在基因组中的位置对基因表达的影响。当外源基因整合到高度甲基化、转录活性低的异染色质区域时，外源基因一般表现沉默，这说明毗邻DNA的甲基化和异染色质化对插入的外源基因影响很大，可能导致外源基因在转录水平上失活。
如果整合到甲基化程度低、转录活性高的常染色体上，其表达受两侧DNA序列的影响。用玉米转座子A1对转基因矮牵牛的染色体进行实验，发现只有插入的DNA被高度甲基化，基因表现沉默，而其两侧DNA序列仍保持较低的甲基化程度，并能正常转录；还发现A1基因GC含量为52.5%，其插入两侧矮牵牛基因组DNA序列的GC 含量明显较低，分别为26%和23%。在其他外源基因沉默的转基因植物中也发现了类似现象，这表明生物体可能通过不同的GC 含量来识别侵入的外源基因，是宿主DNA对可能受到伤害的一种细胞防御反应。
2.启动子区域或5′端非编码区域的甲基化
转基因植物中甲基化也会导致外源基因的失活。一般来说，DNA上的腺嘌呤都可能被甲基化，外源基因编码区域的甲基化对基因表达的作用并不明显，通常检测不到对转录的影响。而外源基因启动子区域或5′端非编码区域的甲基化引起启动子失活或不能起始转录，在转录水平上诱导了外源基因的沉默。重复序列诱导的DNA甲基化和上位效应是诱导转基因植物中外源基因启动子区域或5′端非编码区域甲基化的主要因素。
3.重复序列诱导的DNA甲基化
当转化基因以正向重复（direct repeated，DR）或反向重复（inverse repeated，IR）插入时，容易引起外源基因的失活，这种重复序列诱导的基因沉默（repeat‐induced gene silencing，RIGS）往往与DNA的甲基化相关。一般情况下，一个位点插入的外源基因拷贝数越多，失活的程度越高。导致重复插入的外源基因启动子区域甲基化的机制，可能是细胞对位点重复特性的一种反应。重复序列间容易自发产生异位配对，反向重复的DNA可能形成十字结构，这些构象的DNA易成为DNA甲基转移酶作用的底物；重复序列间的异位配对还可以导致自身的异染色质化，异染色质化相关蛋白质能识别重复序列间配对形成的拓扑结构，并与之结合，将重复序列牵引到异染色质区，或直接使重复序列局部异染色质化。
Wassengger 等研究认为植物细胞中存在一种RNA诱导的DNA甲基化（ RNA‐directedDNA‐methylation，RdDM）的现象，在一定情况下RNA也可能引起DNA启动子区域甲基化。在烟草转化体中发现，由CaMV 35S 启动子驱动的3～4个正向或反向重复的病毒cDNA常被甲基化。如果插入的是单拷贝或双拷贝的病毒cDNA，在植物进一步被病毒RNA感染时也会被甲基化，说明病毒RNA是造成同源外源基因甲基化的主要原因，而不是外源基因的结构或整合位置。病毒RNA与同源的外源基因可能形成DNA‐RNA杂合体，成为DNA甲基化酶作用的特异底物。
4.上位效应
一个沉默的外源基因位点会导致上位另一个同源的外源基因的沉默。在研究含有两个外源基因表达载体的转基因烟草时，发现有15%的双转化体表现卡那霉素（Kan）敏感，而Kan 抗性可以随着自交后代两个外源基因表达载体的分离而恢复，说明另一个表达载体的存在造成了nptⅡ基因在双转化体中的失活。分析两个表达载体的结构，其中nptⅡ基因与ocs基因具有相同的胭脂碱合成酶基因启动子，但位于不同的基因表达载体上，因此nptⅡ基因的沉默可能与两个同源启动子的存在有关，进一步实验证明这种失活是由于转录水平很低造成的。对这种由于异位同源启动子的存在而导致的基因沉默，一种假说认为异位同源序列相互结合可形成DNA‐DNA配对，由于不同来源的DNA甲基化程度不同，形成的杂种DNA分子多呈不完全甲基化状态，在植物细胞内极易过渡到完全甲基化状态，由此抑制了基因的转录和表达。
10.5.2转录后水平上外源基因的沉默（PTGS）
在此情况下，启动子是活跃的，外源基因也能被转录，但不能正常积累mRNA。当转基因植株中存在与外源基因同源的内源基因时，不但外源基因在转录后水平上失活，也诱导了与之同源的内源基因的沉默。由于外源和内源基因都表现沉默，故又被称为共抑制现象（cosupression）。共抑制首先是在研究与花色素形成有关的基因中观察到的，共抑制是一个复杂的过程，目前提出了一些假说。
1.RNA阈值模型
该模型认为，由于外源基因的高水平转录，以至于积累到某个阈值，从而启动了降解特定mRNA的反应，造成转录后水平上的基因沉默（PTGS）。PTGS 一般与外源基因的高水平转录相关，并呈抗病性。外源基因转录水平高的转基因植株不积累外源基因的mRNAs，也不被同源RNA病毒所感染；外源基因转录水平低的转基因植株，通常积累正常水平的外源基因mRNA，但易被相应的病毒感染，这个结果支持了假设的RNA阈值模型。但是某些共抑制现象与转基因植株中外源基因的mRNA转录量无关，如转基因矮牵牛中chs 基因的沉默也不完全与外源chs 基因较高的转录水平有关。这表明共抑制与非正常mRNA和正常mRNA的比率相关，这些非正常的mRNA是激活转录后水平基因沉默所必需的。
2.甲基化诱导的PTGS
PTGS 常与外源基因的甲基化有关。Ingelbrecht 等在一株外源基因npt Ⅱ发生了PTGS的转基因烟草中，发现np t Ⅱ基因上游和下游区域被甲基化，甲基化引起外源基因转录的非正常终止产生非正常mRNA。English 等对转基因烟草的研究提供了更为直接的证据，发现当外源的uidA 基因发生转录后水平基因沉默时，其含poly（A）的3′端区域高度甲基化，且这个区域是转基因烟草保持抗病性所必需的，说明DNA甲基化可能与RNA水平上的基因沉默相关。但是当因外源基因甲基化而发生共抑制时，共抑制的内源基因却能正常转录而没有被甲基化，因此还不能完全认定甲基化是引起共抑制的原因。
3.RdRP‐cRNA模型
该模型认为在植物的细胞质中存在一种依赖于RNA的RNA合成酶，能以mRNA为模板合成小片段的互补RNA（complementary RNAs，cRNA），cRNA与mRNA杂交，从而成为专一性作用于双链RNA的RNA降解酶的底物。已从番茄中发现了RdRP，体外实验证明该酶能以RNA为模板合成cRNA，在体内这些cRNA杂合到相应的mRNA上，被特异的RNA降解酶降解。RdRP‐cRNA模型可以很好地解释PTGS 很强的序列特异性。在研究转基因豌豆chs 基因共抑制现象时，检测到3′端截短的mRNA，测序结果表明是由正常mRNA经剪切衍生来的，由于在某种程度上对原始转录子的处理遭到破坏，对mRNA的非正常剪切产生大量非正常mRNA。
研究还表明，T‐DNA的多拷贝插入也有利于产生大量非正常RNA。这些非正常RNA可能作为RdRP 的底物，从而激活了RNA降解机制，导致外源基因转录后水平上的沉默。此外，还有“异位配对”模型认为异位配对的DNA转录出异常的RNA（rRNA），在植物原生质中rRNA与RNA相互作用，使其降解，导致内外源基因的共抑制；“衰退调控”模型认为在外源基因反向重复的转基因植物中，从正链转录的反义RNA可与从负链转录的RNA形成双链RNA，进而干扰mRNA的加工和翻译。
转基因植物中外源基因的沉默是植物细胞中基因表达调控的结果。真核生物的基因表达调控表现在多种水平上，因此造成转基因植物中外源基因沉默的因素有很多，这些众多的因素不一定在某一转基因植株中同时起作用。通过对大量转基因植株实例的分析和研究，从分子水平上阐明外源基因发生沉默的机制，以提高基因表达效率，是顺利开展植物基因工程的迫切需要。
10.6植物转基因沉默防止与抑制策略
外源基因能否在植物体内稳定整合、遗传和表达决定了转基因植物的使用价值。植物转基因沉默是造成转基因植物非孟德尔遗传的主要原因，对于转基因作物的利用产生了非常不利的影响，已成为影响转基因技术推广应用的主要问题之一。根据转基因沉默抑制策略的时间先后，可以将抑制策略大致分为转化前防止与转化后抑制。
10.6.1转化前防止策略
转化前防止是指在将外源基因转入植物之前，修饰外源基因，选择适当的转导方法，以达到优化外源基因密码子、避免同源序列等目的，从而避免植物自身发生转基因沉默或者降低其发生转基因沉默的概率。
1.避免使用同源序列
同源序列是公认的产生转基因沉默的主要诱因，其转录可能会造成某种内源mRNA的过表达，从而导致RdRP 被激活，由于RdRP 能够指导不依赖引物的RNA互补链的合成，从而产生dsRNA，进而发生RNA沉默。因此，在构建表达载体时，应尽量降低所设计序列与宿主植物内源基因的同源性，从而避免共抑制现象的发生。
2.修饰外源基因
植物基因组中所含有的碱基组成比较固定，GC 或AT 的含量在不同种间又具有差异。
如果整合到植物DNA上的外源基因GC 含量与整合位点差异较大，就会被植物识别，造成外源基因DNA的甲基化，从而发生转基因沉默。如玉米中A L 基因的GC含量为52.5%，而在转A L基因沉默的矮牵牛中，A L基因两侧DNA序列的GC含量分别为26%和23%，明显低于52.5%，检测到A L基因超甲基化，而其两侧DNA的甲基化程度并不高，这表明植物体内有一套识别系统能够通过比较外源基因与两侧DNA的GC含量来识别外源基因，进而激活甲基化酶，使外源基因甲基化。
3.选择偏爱密码子
基因的高效表达与载体生物使用的密码子及tRNA的数量匹配关系有关。因此，使用宿主植物偏爱的密码子，使转入的外源基因的密码子能够适应宿主植物的tRNA，也是避免基因沉默的一个策略。
4.核基质结合序列
核基质结合序列（matrix attachment region，MAR）是染色质上的一段序列，长度一般为300～1000bp，通常富含AT，它可以与核骨架相结合。两个MAR 之间的染色质区域可形成大小为5～200kb 的DNA环，构成一个独立的表达结构。因此，在目的基因的两侧翼接上MAR 序列，利用MAR 对染色质结构的直接限制，使目的基因不受周围染色质顺式调控元件的影响，相邻的转录单元保持相对的独立性，从而保证了转录的正常进行，提高了转基因的表达效率。近来多项研究表明，利用MAR 与转基因构件转化载体协同转化植物后，转基因植物中转基因的表达量大幅度提高，同时避免了转基因的位置效应和转基因的沉默。如MAR 序列的存在可以有效地缩小β葡糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因在转基因植物当代和子代表达的变化程度。
