现已发现，一些真核生物的基因也能够在大肠杆菌中表达，并且还能够与宿主菌株中出现的缺陷型突变发生互补作用。利用外源基因对宿主细胞的这种互补作用的筛选方法，已成功地分离到了小鼠的二氢叶酸还原酶（di hydro folate reductase，DHFR）基因。具体的实验步骤是，先将含有DHFR mRNA的小鼠总mRNA反转录为cDNA，构建cDNA文库。根据小鼠DHFR 对于药物三甲氧苄二胺嘧啶（trimethoprim）呈现抗性这种性状特征，将转化的细菌生长在含有三甲氧苄二胺嘧啶的培养基中（其含量水平为可以抑制大肠杆菌的DHFR的活性），选择转化子。这样分离出来的抗性克隆，显然都是由于具有小鼠dhf r基因的克隆片段，赋予宿主细胞新的抗性表型所致。这是关于哺乳动物结构基因在大肠杆菌中实现表达的一个早期例子。当然，影响异源基因表达的因素是多方面的，复杂的。因此，为了从那些含有不表达的DHFR cDNA的克隆中鉴定出合成小鼠DHFR酶的克隆，需要一种有效的选择程序。
根据克隆片段为宿主提供的新的表型特征选择重组体DNA分子的直接选择法，是受一定条件限制的，它不但要求克隆的DNA片段必须大到足以包含一个完整的基因序列，而且还要求所编码的基因能够在大肠杆菌宿主细胞中实现功能表达。无疑，真核基因是比较难以满足这些要求的，原因在于有许多真核基因是不能够与大肠杆菌的突变发生抑制或互补效应的。此外，大多数的真核基因内部都存在着间隔序列，而大肠杆菌又不存在真核基因转录加工过程中需要的剪接机理，这样便阻碍了它们的大肠杆菌宿主细胞中实现基因产物的表达。当然，在有些情况下，可以通过使用mRNA的cDNA拷贝构建重组体DNA的办法来解决这些问题。
7.5物理检测法
常用重组体分子的物理检测法主要有凝胶电泳检测法和R 环检测法两种。
7.5.1凝胶电泳检测法
重组体分子是载体与外源DNA片段的结合，因此携带插入DNA片段的重组子在相对分子质量上要大于载体本身。根据重组体DNA分子的大小，可以判断出载体上是否加载了外源DNA片段。通过凝胶电泳检测，就能够快速地判断出DNA相对分子质量的大小。因此，凝胶电泳检测法已成为重组子筛选与检测中一种简单、直接的常用方法。
电泳检测筛选比抗阳性插入失活平板筛选更进一步。有些假阳性转化菌落，如自我连接载体、缺失连接载体、未消化载体、两个相互连接的载体以及两个外源片段插入的载体等转化的菌落，用平板筛选法不能将其鉴别开来，但可以被电泳法鉴别与淘汰。因为由这些转化菌落分离的质粒DNA分子的大小各不相同，与真正的阳性重组体DNA分子相比，前三种DNA分子较小，在电泳时迁移速度较快，其在凝胶上的位置位于真阳性重组体DNA分子的前面；相反，后两种DNA分子较大，电泳迁移速度较慢，其在凝胶上的位置位于真阳性重组体DNA分子的后面。所以，凝胶电泳检测法能筛选出有插入DNA片段的真阳性重组体。
凝胶电泳检测法包括直接凝胶电泳检测法、酶切检测法与PCR检测法。
1.直接凝胶电泳检测法
直接凝胶电泳检测法就是从转化菌中分离出重组质粒DNA后，直接将其点样于凝胶上进行电泳，根据重组质粒DNA在凝胶上的迁移位置，确定其相对分子质量大小，最后判断其是否为真正的重组体。
直接凝胶电泳检测法常用的操作程序为：分别挑取单个转化菌悬浮于破碎细胞缓冲液（50mmol/L Tris‐HCl、1%SDS、2mmol/L EDTA、400mmol/L 蔗糖、0.01%溴酚蓝）中，37℃保温使细胞破裂，蛋白质沉淀，再高速离心，除去细胞碎片、蛋白质和大部分的染色体DNA、RNA，将含有质粒DNA的上清液直接点样于琼脂糖凝胶上，电泳分离，经EB 染色后，用凝胶成像系统观察并拍照，获得可显示含有染色体DNA、不同大小的质粒DNA以及RNA的电泳图谱。最后，根据电泳条带迁移率来判断相对分子质量的大小，这样就能容易地判断出哪些菌落是含有外源DNA插入片段的重组质粒。
除了上面所述的细胞破碎法鉴定转化子之外，还可以使用煮沸法（boiling）快速分析转化子DNA。此法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用，不仅快速简单，能同时处理大量试样，而且所得DNA有一定的纯度，能满足其他核酸分析的要求。
其具体方法是：从琼脂平板上分别挑取单克隆接种培养过夜，取1.5mL 菌液离心，剩余培养液保存，等待结果出来选择重组子备用。将菌落沉淀悬浮于STET （0.1mol/L NaCl、10mmol/L Tris‐HCl、10mmol/L EDTA、5%Triton X100）中，破碎细胞壁与细胞膜后，立即在沸水中煮沸40s，让质粒DNA快速释放出来，离心，使变性的大分子染色体DNA、蛋白质及大部分RNA与细胞碎片等一起沉淀而弃去。取上清质粒DNA点样电泳，根据外源DNA插入序列重组质粒相对分子质量增大这一特性，即可判断出具有外源DNA插入序列的重组质粒。
上述根据DNA的相对分子质量大小鉴定重组子的方法，适用于载体DNA与重组DNA相对分子质量差别较大的比较，如果两种DNA相对分子质量之间相差小于1kb，也即插入的外源DNA片段小于1kb，加上各质粒DNA之间还存在三种构型的差异，DNA的大小比较就有困难。在这种情况下，一般将快速抽提出的转化子DNA和原载体DNA用单一识别位点的限制性内切酶切割后，再进行凝胶电泳比较。
2.酶切检测法
在外源DNA片段的大小以及限制性酶切图谱已知的情况下，往往采用酶切检测法来鉴定重组子。酶切检测法不仅能够区分重组子与非重组子，而且有时还能够区分出期望的重组子与非期望的重组子。因此，这种方法是常用的重组子筛选与鉴定的方法之一。
酶切检测法的操作程序为：挑取经初步筛选的重组子菌落，进行少量培养，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶切割重组子，释放出插入片段，然后通过凝胶电泳观察其电泳图谱。如果电泳图谱上显示的插入片段的大小与供体的目标片段大小一致，则说明这个重组子正好是携带有目标片段的期望重组子；否则，这个重组子不是期望的重组子。如果目的DNA片段自连后与载体连接获得多聚体转化子，那么电泳图谱上将出现类似于期望重组子的带型，但插入片段在凝胶上的亮度比正常的条带要强一倍以上。因此，根据插入片段的亮度，也能够将这种重组子准确地辨别出来。
3.PCR检测法
PCR检测法是基于PCR技术发展起来的、并被广泛应用的一种重组子筛选与鉴定方法。
PCR检测法就是根据载体克隆位点两端的序列或目的DNA片段两端的序列，设计出一对特异的扩增引物，以转化生长的细菌质粒DNA为模板进行扩增，并用凝胶电泳检测PCR产物，如果电泳图谱上出现了与预期长度相符的扩增片段，则认为这个被检测的克隆可能就是含有目的DNA片段的重组子。
PCR检测尽管是一种有效、方便的检测手段，但若插入的外源DNA太大，超过3.5kb 时，扩增起来则比较困难，用PCR检测法效果不佳。
7.5.2R 环检测法
R 环检测法的基本原理是，在接近双链DNA变性温度下和高浓度（70%）的甲酰胺溶液中，双链的DNA‐RNA分子要比双链的DNA‐DNA分子更稳定。因此，将RNA及DNA的混合物置于这种退火条件下，RNA便会与其中的一条DNA互补结合，退火形成稳定的DNARNA杂交分子，从而使被取代的另一条DNA链处于单链状态。这种由DNA单链分支与DNA‐RNA杂交双链所形成的“泡状”体，叫做R 环结构。R 环结构一旦形成就十分稳定，而且在电子显微镜下能够观察到。所以采用R环检测法可以容易地鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区段。
我们可以根据这样的原理，将R环检测法用于重组子的筛选与鉴定中。首先分离获得外源目标DNA片段转录出来的mRNA，然后把待检测的纯化的质粒DNA与该mRNA混在一起，在有利于形成R环的条件下，让质粒DNA局部变性。如果质粒DNA分子上插入了外源的目标片段，那么在退火条件下，mRNA就会与插入片段互补配对，形成R环结构。通过电子显微镜观察，就可以检测出重组子质粒的DNA分子。
7.6核酸分子杂交检测法
利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待测的核酸序列和插入片段基因制备的DNA或RNA探针。根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固体支持物上的不同，核酸杂交主要有菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交和Southern印迹杂交。这些方法都是通过一定的物理方法将菌落（或噬菌斑）或提取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后与液体中的探针进行杂交。菌落（或噬菌斑）或DNA从平板或凝胶向滤膜转移的过程称为印迹（blotting），故这些杂交又都称为印迹杂交。
7.6.1菌落印迹原位杂交
菌落印迹原位杂交就是将待检测的菌落转移到硝酸纤维素滤膜上，然后再利用探针检测细菌或噬菌斑中特异的DNA序列或基因，从中筛选出重组子阳性克隆。这种方法最早是由M.Grunstein和D.Hogness（1975）发明的，接着经过D.Hanahan和M.Meselson（1980）改良之后，便可适用于高密度菌落杂交筛选，使重组子检测效率大大提高。这对于从成千上万的菌落或噬菌斑中鉴定出含有重组体分子的菌落或噬菌斑具有特殊的使用价值。
这种方法的基本操作程序为：将被筛选的菌落，从其生长的琼脂平板中通过影印方法，小心地原位转移到放在琼脂平板表面的硝酸纤维素滤膜上，并保存好原来的菌落平板作为参照，以便从中挑取阳性克隆。菌落转移时一定要在琼脂平板与硝酸纤维素膜的相应位置做好标记，便于以后辨认原始菌落。取出已经长有菌落的硝酸纤维素滤膜，用碱处理，于是细菌菌落溶解，它们的DNA也就随之变性。然后再用适当的方法处理滤膜，以除去蛋白质，留下的便是与硝酸纤维素膜结合的变性DNA。因为变性DNA与硝酸纤维素膜有很强的亲和力，所以在膜上形成DNA的印迹。在80℃下烘烤滤膜，使DNA牢固地固定下来。用带有放射性标记的特定DNA探针与滤膜上的由菌落释放并变性的DNA杂交，漂洗除去多余的DNA探针，然后通过放射自显影技术显示杂交结果。含有与探针序列互补的菌落DNA，就会在X 光胶片上出现曝光点。根据曝光点的位置，可以从保留的模板上相应的位置上挑出含有目标插入片段的重组体克隆。
7.6.2斑点印迹杂交
斑点印迹杂交法与菌落印迹原位杂交的原理一样，但方法更简单、迅速。斑点印迹杂交法的具体操作是：培养待筛选鉴定的菌落，提取其DNA，将DNA变性后，直接点样于硝酸纤维素膜上，然后同核酸探针进行分子杂交。通过放射自显影，从底片中找出黑点即为阳性斑点。
斑点印迹杂交法是实验室常用技术之一，常用于基因组中特定基因及其表达的定性及半定量研究，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；对于核酸粗提样品的检测效果也较好。缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，不能确定外源DNA在细胞染色体中的整合情况，而且特异性不高，有一定比例的假阳性。
7.6.3Southern印迹杂交
Southern印迹杂交是指将电泳分离的DNA片段从凝胶中转移到一定的固相支持物上进行杂交的过程。该转印技术是在1975年由E.M.Southern建立的，故称为Southern印迹杂交法。
Southern印迹杂交法是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法，常用于对上述原位杂交所得到的阳性克隆的进一步分析，检测重组DNA分子中插入的外源DNA是否是原来的目的基因，并验证插入片段的相对分子质量大小。
