（4）尼龙膜的不足之处是背景较高，用RNA探针时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中，会导致杂交背景明显升高，可通过提高预杂交和杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。
（5）如用中性缓冲液进行RNA转移，转移结束后，将晾干的尼龙膜夹在两张滤纸中间，80℃干烤0.5～2h，或者254nm 波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。后一种方法较为繁琐，但却优先使用，因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后，杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果，务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构，而过度照射却使RNA上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。
4.4.5Western 杂交
Western 杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性的蛋白质检测方法。
其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，通过SDS PAGE 电泳将蛋白质按相对分子质量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及相对分子质量等情况。
因此，Western 杂交的总体过程也与Southern杂交相似，只不过在印迹转移过程中转移的是蛋白质而不是DNA。这种将蛋白质样品从SDS PAGE凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法，称为Western 印迹转移。其后的杂交过程不是真实意义的分子杂交，而是通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其相对分子质量。所用的探针不是DNA或RNA，而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。
Western 杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。这种检测方法与其他免疫学方法的不同是，可以避免非特异性的免疫反应，而且更关键的是可以检测出目的蛋白质的相对分子质量，直观地在滤膜上显示出目的蛋白。
4.5核酸的序列分析技术
核酸的碱基顺序分析是基因工程和分子生物学的重要技术之一。核酸的碱基顺序分析方法已经过近年的发展，具体方法五花八门、种类繁多，但是究其所依据的基本原理，不外乎Sanger F 的核酸链合成终止法及Maxam A 和Gilbert W 的化学降解法两大类。虽然原理不同，但这两种方法都同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点。由于DNA链上每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因而上述每一组产物都是一些寡核苷酸的混合物，然后对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道之上，即可从凝胶的放射自显影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。
4.5.1Maxam Gilbert 碱基顺序分析法
1975年，Maxam A 和Gilbert W发展了一种核酸碱基顺序快速分析方法。这种方法的基本原理是应用有机化学方法，选择性地切断某种特定核苷酸（A，G，C，T）所形成的磷酸酯键，所以此法又称为化学降解法（chemical cleavage method）。
Maxam Gilbert 化学法的基本步骤为：对某特定DNA片段的一端进行放射性标记，在适当的条件下，用不同专一性的化学试剂特异性地修饰DNA分子上的碱基，使每条DNA链上仅有一个碱基被修饰，接着从DNA链上除去已被修饰的碱基，DNA则在这个部位被切断，得到的各种长度的带放射性标记片段在聚丙烯酰胺变性胶上电泳，长度仅相差一个核苷酸的片段依次分离，经放射自显影，可以读出约200个核苷酸的顺序。Maxam Gilbert法所能测定的长度要比Sanger 法短一些，它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。
一般采用下述试剂进行处理：
1.用硫酸二甲酯使G上的N7位和A上的N3位甲基化。甲基化使糖苷键在中性环境下极易水解，G或A碱基脱落，多核苷酸骨架发生断裂。
2.用酸处理，可使G或A上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶处理使G发生β消除反应，导致DNA链仅在G处断裂。
3.用肼处理使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基；在高浓度NaCl存在下，肼只与C发生反应，断裂的C可用哌啶除去。
例如，有一个DNA片段，组成是：5′－32P－GCTACGTA－3′，它在特异切断中，可得如下带有32P的各种片段：
在A 处切断：32P－GCT 32P－GCTACGT
在G 处切断：32P－GCTAC
在C 处切断：32P－G 32P－GCTA
在T处切断：32P－GC 32P－GCTACG
4.5.2Sanger 碱基顺序分析法
1976年，Sanger F 发展了一种新的核酸碱基顺序分析法。Sanger 法比Maxam Gilbert法应用更为广泛，因为它能用于测定更长的多聚核苷酸链的碱基顺序，并且可以实现分析过程的自动化。
Sanger 法的基本原理与Maxam Gilbert 法有相似之处，都是通过得到多种不同长度的聚核苷酸片断，进行凝胶电泳后从电泳图谱上读出被测多聚核苷酸的碱基顺序。但是，它们在实施方法上完全不同。此法是将待测定的DNA单链作为DNA复制的模板，在DNA聚合酶（DNApolymerase，一种催化DNA合成的酶）催化下，在有四种脱氧核苷三磷酸（2′‐deoxynucleoside triphosphate，dNTP）和四种脱二氧核苷三磷酸（2′，3′dideoxynucleoside triphosphate，ddNTP）参与下，合成出各种长度的DNA片断，再进行凝胶电泳和放射性显影，从图谱上直接读出待测DNA的互补碱基顺序。由于此法的关键是利用脱二氧核苷三磷酸终止DNA链的增长而实现的，所以又称为链终止法（chain terminator method）。
在DNA聚合酶作用下，ddNTP 可以和dNTP 同时参与DNA链的合成。当ddNTP 与脱氧核苷酸链端基的3′OH形成磷酸酯键后，由于ddNTP 本身的3′H 不能继续参与链增长反应，因而成为链的终端。因此，在以待测的DNA单链为模板进行复制时，就可以得到以四种ddNTP 为终端的不同长度的DNA片断，而这些片断相当于用Maxam Gilbert 法水解得到的片断。
具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸，并在四组反应中各加入适量的四种之一的脱二氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酰胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列。
（从Sanger 法得到的图谱中直接读出的碱基顺序实际上是与待测DNA链互补的DNA链的碱基顺序。）利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ所具有的特性，用一条单链DNA作模板，在引物和4种脱氧核苷三磷酸存在下，合成一条新的与模板互补的DNA链；如果在4种脱氧核苷酸中有一种或几种是带放射性标记的，那么随着它们的掺入，新合成的链将是带放射性标记的。如果在反应混合物中加入一种脱氧核苷三磷酸的类似物，即2′，3′双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3′末端，由于它的脱氧核糖上缺乏3′OH基，因而终止DNA链的延长。
有两类DNA可以用作Sanger法测序的模板：纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA。采用通常从重组M13噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA模板效果最佳。
通常用于双脱氧链终止法序列测定的有几种不同的酶，其中包括大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片段、反转录酶、T7噬菌体DNA聚合酶以及从嗜热水生菌分离的耐热DNA聚合酶。这些酶的特性差别悬殊，因而可大大影响通过链终止反应所获得的DNA序列的数量和质量。
（1）大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段
这种酶是最初用以建立Sanger法的酶。Klenow片段的持续合成能力低，以致一些片段并非由于ddNTP的掺入，而是因为聚合酶从模板上随机解离而终止合成，因而导致背景增高。由于该酶不能沿模板进行长距离移动，因此利用该酶进行的标准测序反应所得序列的长度有限。
（2）反转录酶
尽管测序工作并不广泛使用反转录酶，但有时用这个酶来解决一些由于模板DNA中存在重复A/T或G/C的同聚核苷酸区而引起的问题。来自禽类和鼠类反转录病毒的反转录酶在这一方面要比Klenow 酶略胜一筹。
（3）测序酶
测序酶是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。该酶原来具有很强的3′→5′外切核酸酶活性，经过修饰后，这一活性大部分被消除。测序酶持续合成能力很强，聚合速率很大，它是测定长段DNA序列的首选酶。
（4）TaqDNA聚合酶
TaqDNA聚合酶适用于测定在37℃形成大段稳定二级结构的单链DNA模板序列。这是因为TaqDNA聚合酶在70～75℃活性最高，这一温度下即使GC 丰富的模板也无法形成二级结构。
双脱氧链终止法如今远比Maxam Gilbert 法应用得广泛。然而，化学降解法较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝。
因此，利用Maxam Gilbert 法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，还可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。
4.5.3自动化测序法
Prober 等在1987年，将链终止法加以改进，并与电子计算机程序的自动化技术相结合，加快了序列测定进程。具体步骤是在每种双脱氧核苷酸上分别都以共价键接上不同荧光染料，然后与四种三磷酸核苷在同一器皿中，依照链终止法条件进行，即会复制出一系列不断增加较长一点的多聚脱氧核苷酸链，其3′末端都各自带有特色荧光染料的双脱氧核苷酸。为了测定序列，将反应混合物在一条道上进行凝胶电泳，结果这条道上出现一系列有荧光的带；每一条带都代表一个碱基在复制链中所在的位置。凝胶荧光测定体系由电子计算机控制。这个体系是用激光激发不同颜色的染料所发生的荧光，用短波长的蓝光及长波长的红光分别测定荧光强度之比值，测定在复制链中各碱基的位置，从而得到DNA的序列。
4.6核酸和蛋白互作研究技术
4.6.1酵母双杂交技术
酵母双杂交系统是由Fields 和Song 等首先在研究真核基因转录调控中建立的。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有两个不同的结构域：DNA结合结构域（DNAbindingdomain）和转录激活结构域（tranion‐activating domain）。DNA结合结构域可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游；转录激活结构域可与转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。两个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
酵母双杂交体系是一种利用一个报告基因检测两种蛋白质是否有相互作用的系统。使用该系统并不需要操作蛋白质，不需对蛋白质进行分离纯化，更多的是DNA和微生物学的操作。
许多真核生物的转录因子含有相对独立的DNA结合功能域（binding domain，BD）和转录激活功能域（activation domain，AD）。当两个功能域独立存在时，不表现转录激活功能。
