第13章 病原学、免疫学及生化检测 (5)
②结果报告。应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告结果，单位为cfu／g（ml）。有较大片状菌落生长的平板，不宜采用，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘以2代表全皿菌落数。平板内如有链状菌落生长时，若仅有一条链，可视为一个菌落，如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落。若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视两者之比来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字。若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。若所有稀释度均无菌生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分＞300或＜30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告。菌落数在100以内时，按其实际数报告，＞100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。
（2）大肠菌群
①操作步骤。根据食品卫生标准要求，选择3个适宜稀释度，每个稀释度做3管，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，置36℃±1℃培养24小时±2小时，如有产酸产气管，接种EMB，置36℃±1℃培养18～24小时后，挑取可疑菌落1～2个进行革兰染色镜检，同时接种乳糖发酵管置36℃±1℃培养24小时±2小时做证实试验。
②结果报告。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产酸、产气管，根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
（3）真菌和酵母计数
①操作步骤。根据食品卫生标准要求，选择3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，吸取1ml稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做2个培养皿，将孟加拉红琼脂（46℃）注入平皿摇匀，培养温度25～28℃，3天后开始观察结果，共培养观察5天。
②结果报告。选择菌落数在10～150之间的平皿进行计数，同稀释度的2个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即每克（或ml）检样中所含真菌和酵母数以cfu／g（ml）表示。稀释度选择及菌落报告方式可参考菌落总数的报告。
3.质量控制
（1）主要仪器
①恒温培养箱。每天观察记录温度情况，每年由计量部门检定1次。
②高压灭菌器。记录好使用记录，每周1次灭菌效果监测，每年由计量部门检定1次。
③干热灭菌箱。记录好使用记录，每年由计量部门检定1次。
（2）耗材
①主要耗材。营养琼脂、乳糖胆盐培养液、伊红亚甲蓝琼脂、乳糖发酵培养液、孟加拉红培养基。
②耗材质量控制。购进的每批培养基在使用前进行培养基质量鉴定，鉴定合格后使用，鉴定方法见本节第六部分培养基质量控制方法。
（3）实验室内部质量控制
①所检项目内控。菌落总数、真菌和酵母计数每批样品采用稀释液空白和培养基空白对照，大肠菌群每批样品采用所需培养基做空白对照。
②环境内控。对净化室每天进行实时监测，每周进行1次空气消毒监测，每半年进行1次紫外灯效果监测，每年进行1次尘埃粒子监测。
二、水的细菌学检测
（一）基本理论
1.水中的微生物
水中微生物的卫生学意义：水是我们人类赖以生存的重要环境之一，同时在一定条件下又可成为疾病传播的重要途径，每年世界各地均有经水传播的疾病流行和暴发的报告。水主要传播以下疾病。
①肠道感染性疾病经水传播的肠道疾病的病原微生物主要有伤寒沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、致病性大肠埃希菌、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒等。
②经皮肤、黏膜接触的水源性疾病常在捕鱼、洗衣、游泳等接触疫水后引起。如钩端螺旋体引起的钩端螺旋体病、沙眼衣原体引起的沙眼、铜绿假单胞菌引起的外耳感染等。
③通过水产品、水生植物、食物加工用水引起的疾病。
2.水中的细菌
水中的细菌群的种类很多，且不同的水质差异很大，这是因为受到土壤菌群、生活用水、工业废水、空气菌尘等的影响，所以不同的水质菌群变化很大。
（1）地面水：无污染的高山溪水以无色杆菌为主。地面湖水、池塘水则以无色杆菌、黄色杆菌减少而假单胞菌、肠杆菌科细菌较多。河水中除上述菌尚有弧菌、微球菌、螺旋体等。被生活污水、污物污染的水还有人及动物粪便中的细菌，无疑会出现肠道致病菌。主要有志贺菌属菌、沙门菌属菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、铜绿假单胞菌和肠道常见的变形杆菌、大肠埃希菌、粪肠球菌。
（2）地下水：因土壤的过滤作用且营养少，细菌比地面水少，主要是革兰阴性无芽孢杆菌特别是无色杆菌而无弧菌、螺菌、棒状杆菌和分枝杆菌及真菌。温泉水中可查见耐热硫化菌。
（3）海水中的细菌：海水中含有比较高的盐，其水中的微生物与淡水的微生物有很大区别。但近海海水因河水入海使陆地与海洋细菌混杂。可分离到大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、铜绿假单胞菌和副溶血性弧菌，还可查到霍乱弧菌。海水中细菌的分布与深度有关，菌的数量与深度成反比，在5～50m深处细菌数量最多，深度超过50m则较少。大多为嗜盐菌及嗜冷菌。
3.水中的其他致病微生物
水中除上述细菌外还可查见病毒、钩端螺旋体等其他致病微生物。常可查见的病毒有甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒等。还可查见沙眼衣原体等其他微生物。
（二）基本知识
1.水的微生物指标
生活饮用水和水源水常规指标：总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希菌、菌落总数；非常规指标：贾第鞭毛虫、隐孢子虫。
2.菌落总数
水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48小时后，所得1ml水样所含菌落的总数。菌落总数的增加，表明水体受到有机污染，但不能阐明污染来源。我国规定饮用水中菌落总数的限值为100cfu／ml。
3.总大肠菌群
总大肠菌群指一群在37℃培养24小时能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。总大肠菌群是评价水样的一个重要指标。总大肠菌群在自然环境的水和土壤中也能经常存在。大肠菌群性质稳定，在粪便中的数量多，在一些腐殖质中也含有，易检测，其检出量与水体受人畜粪便污染的程度呈正相关。我国规定饮用水中总大肠菌群的限值是每100ml水中不得检出。
4.耐热大肠菌群
用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。耐热大肠菌群来自温血动物粪便，也可来自环境，作为大肠埃希菌的替代指标。水体出现耐热大肠菌群，表明该水体已被粪便污染，水中可能存在肠道致病菌和寄生虫等病原体。我国规定饮用水中耐热大肠菌群的限值：每100ml水中不得检出。
5.大肠埃希菌
在含有荧光底物的培养基上44.5℃培养24小时产生β-葡萄糖醛酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光的细菌，以此来检测水中大肠埃希菌。大肠埃希菌来自温血动物和人的粪便，作为粪便污染的最理想指标。我国采用WHO和许多国家规定的限值，每100ml水中不得检出。
6.水样的采集、保存、运送
（1）采集水样时应注意无菌操作，以防杂菌混入，盛水容器需灭菌后备用。
（2）同一水源、同一时间采集几类检测指标的水样时，应先采集供微生物学指标检测的水样。采样时应直接采集，不得用水刷洗已灭菌的采样瓶，并避免手指和其他物品对瓶口的沾污。采集前应将水龙头用清洁布拭干，再用乙醇灯烧灼水龙头周围，然后完全打开，放水5～10分钟再将水龙头关小，采集水样。经常取水的水龙头放水1～3分钟后即可采集水样。机井水的采集与自来水相同。
（3）采集井水及江、河、湖等地面水的水样时，应选择无菌采水样瓶，浸入距水面10～15cm深处，然后拉开瓶塞采水，待水盛至4／5后将瓶塞放下塞好，从水中取出。
（4）采取经过氯处理的水时，应在采水样瓶未消毒前加入硫代硫酸钠，中和水中的余氯，避免水中的余氯对水中细菌的杀害作用。具体加量：生活饮用水每125ml水样加入0.1mg硫代硫酸钠。
（5）水样采集后尽快进行检验，不能及时检验的应将水样在4℃冷藏保存，4小时内检测完毕。
（6）运送水样时应用相应防震措施，避免玻璃瓶摇动，以免水样溢出后回流而增加污染。
7.工作流程
接样→查看包装情况→核对标签与送样单信息是否符合→所检项目是否符合卫生标准要求→核对提供的检测依据是否具备检测能力→样品在4℃冷藏保存→积极准备条件进行检验，4小时内检测完毕→3天内出具结果。
（三）基本技能
1.操作步骤及结果报告
（1）菌落总数
①操作步骤。以无菌操作方法用灭菌吸管吸1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，将溶化并冷至45℃的营养琼脂注入平皿内，每皿约15ml并摇匀。每次检验时应做一平行接种，同时做营养琼脂空白对照，待琼脂凝固后翻转平皿置36℃±1℃培养48小时观察结果。水源水选择未稀释的水样和2～3个适宜稀释度的水样1ml，分别注入灭菌平皿内，以下步骤按照上述方法操作。
②结果报告。报告方式参照本节第一部分食品菌落总数的报告方式，单位为cfu／ml。若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之。
（2）总大肠菌群（多管发酵法）
①操作步骤。取5个10ml水样接种到5支10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，取5个1ml水样接种到5支10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1ml注入9ml灭菌盐水中，混匀后取5个1ml水样接种到5支10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，置36℃±1℃培养24小时±2小时。如有产酸产气管，接种EMB，置36℃±1℃培养18～24小时后，挑取可疑菌落进行革兰染色镜检，同时接种乳糖发酵管置36℃±1℃培养24小时±2小时做证实试验。检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度。
②结果报告。如所有乳糖蛋白胨培养管都不产酸、产气，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸、产气管，根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml水样中的总大肠菌群的MPN值。
（3）耐热大肠菌群（多管发酵法）
①操作步骤。如总大肠菌群乳糖发酵试验阴性，则耐热大肠菌群可报告阴性，如总大肠菌群乳糖发酵试验阳性，则自总大肠菌群发酵试验中的阳性管（产酸、产气）中取1滴转种于EC肉汤管中，置44.5℃培养24小时±2小时，若不产气，则可报告结果，若有产气者转种EMB，置44.5℃培养18～24小时。凡平板上有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群阳性。若只检测耐热大肠菌群时，即在第1步乳糖发酵试验时按总大肠菌群多管发酵法第1步操作，置44.5℃±0.5℃培养。
②结果报告。报告方式参照总大肠菌群（多管发酵法）的报告方法。
（4）大肠埃希菌（多管发酵法）
①操作步骤。将总大肠菌群多管发酵法初发酵产酸或产气的管进行大肠埃希菌检测，以无菌操作将阳性管中的液体接种的EC-MUG管中，置44.5℃±0.5℃的培养箱或恒温水浴中培养24小时±2小时。如使用恒温水浴，在接种后30分钟内进行培养，使水浴的液面超过EC-MUG管的液面。将培养后的EC-MUG管在暗处用波长为366nm功率为6W的紫外灯照射，如有蓝色荧光产生则表示水样中含有大肠埃希菌。
②结果报告。报告方式参照总大肠菌群（多管发酵法）的报告方法。
（5）非常规指标：根据地区、时间或特殊情况需要实施的生活饮用水水质指标。具体方法在本节不做介绍。
2.质量控制
（1）主要仪器
①恒温培养箱。每天观察记录温度情况，每年由计量部门检定1次。
②高压灭菌器。记录好使用记录，每周1次灭菌效果监测，每年由计量部门检定1次。
③干热灭菌箱。记录好使用记录，每年由计量部门检定1次。
（2）耗材
①主要耗材。营养琼脂、伊红亚甲蓝琼脂、乳糖蛋白胨培养液、EC培养基、EC-MUG培养基。
②耗材质量控制。购进的每批培养基在使用前进行培养基质量鉴定，鉴定合格后使用，鉴定方法见本节第六部分培养基质量控制方法。
