②标本涂片诊断依据性细胞的出现与否，是镜下提高和判定标本取样合格与否的重要证据，应认真甄别。相关文献证实80%以上的宫颈癌来自颈管交界处的细胞，故合格的涂片常出现包括增生的储备细胞、化生或增生的颈管腺上皮细胞等，若涂片看不到上述细胞和／或异型细胞，常提示取样标本无法评价该部位是否存在病变，应考虑取样的正确性（如痰液标本或纤支镜标本薄层液基涂片中若无纤毛上皮、组织细胞、异型细胞等成分，则同样甚难明确是否存在肺部病变的推定）。
③涂片细胞应为均匀薄层，不出现拥挤重叠或涂片空洞、中央空晕等现象。
④细胞人为假象少，背景清晰，除炎症病变外，通常涂片炎症细胞量少（一般超出75%，则提示涂片质量不佳），出血黏液少见。
⑤细胞染色佳，层次分明，核结构清晰，对比度明显。
（三）免疫细胞化学涂片制作技术
1.提供免疫细胞化学检测的标本，应要求载玻片作预先处理，除玻片洁净处理外，一般载玻片应经多聚赖氨酸浸泡或APES处理，以防细胞脱落。样本涂片后，载玻片应置于密封盒中－20℃冷柜内备检或即刻送相关实验室按免疫细胞化学技术要求作后续处理。
2.用于免疫细胞化学的涂片原则上提倡采用液基细胞学涂片方法为宜，也可采用常规手工涂片方式制片，然后者效果常欠佳（详见相关章节）。
（四）细胞蜡块制作技术
细胞蜡块（Cell Block）是一项将送检标本通过离心浓缩成块后再用石蜡包埋起来切片的细胞病理学技术。对细胞病理学诊断有很大的意义，是一项实用而新兴的细胞病理学技术，该技术可以最大限度地保留残存的组织学结构，细胞及小组织碎片相对集中，有助于获得更多的诊断信息，且可重复多次切片，较适用于特殊染色、免疫细胞化学及分子病理学等辅助检查。现常用制作方法有琼脂凝胶法、血浆凝集法、酒精凝集法等。但其制作需要优质足量的样本为前提，才能获得成功的细胞蜡块。
（五）细胞印片制作技术
细胞印片是通过检查者在直视情况下，直接从病变区（尤其是肿瘤病变）切面印片获取样本进行制片检测的一种方法，常应用于术中印片细胞病理学诊断，具有方法简便、快捷，细胞形态和结构反映真实的特点。尤其在乳腺、甲状腺、软组织、胃肠或淋巴系统等富于细胞的增生性病变或肿瘤良恶性鉴别中常成为独立或辅助诊断的一项有用技术，在一定程度上提高了快速病理诊断的正确率，减少了误诊和漏诊。印片方法亦可应用于免疫细胞化学、组织化学和分子生物学检测技术。
1.印片取样多采用载玻片在病变垂直区切面轻压蘸取细胞，一次成功。避免在载玻片同一部位重复印片，避免平行拖拉，影响细胞变形和重叠。
2.病变区的选择应在典型、质嫩、富含细胞的部位，恶性肿瘤多取自淡粉红鱼肉状区，避免在肿瘤坏死、出血或脂肪过多区取样。
3.为避免出现假阴性，可在病变区同一部位或多部位作印片观察。
4.囊实性病变应尽可能避开囊性区，必要时吸干液体后再行印片。
5.取样标本应即刻固定，切忌高温烧烤、干燥过度，以防细胞变形和人为退变，影响诊断。
6.固定液推荐使用85%乙醇乙醚（30min）或甲醛冰醋酸固定液（30min）。其他固定液如85%乙醇（2min）、4%甲醛乙醇（浓度约为85%）溶液（2～3min）等亦可应用。
（六）压片细胞病理学制作技术
压片细胞病理学技术目前临床应用较少。其方法是将微小病变组织碎块放置于玻片中央，其上放置另一玻片，然后用力挤压两玻片使夹于中间组织铺展，再沿长轴将两玻片向相反方向拉开，制成样本，按常规印片方法固定、染色观察。
（七）细针吸取细胞病理学制作技术
细针吸取细胞病理学诊断方法具有简便、安全、快速、受检创伤小、确诊率高、患者痛苦少等优点，是组织病理学诊断方法的重要补充手段。适用的范围涉及：
（1）体表可触及的肿块，如皮肤、乳腺、软组织、淋巴结、涎腺、甲状腺、前列腺等病变。
（2）可疑的转移性病灶，如淋巴结、皮下结节或骨占位性病变。
（3）因癌瘤播散或因创伤引起大出血、感染不宜手术切除或切取活检而临床必须获取病理形态学依据方可诊治的病例。
（4）经皮或借助影像学仪器对深部脏器（包括颅脑、胸腹腔、盆腔）病变的术前、术中快速诊断。
（5）肿瘤放化疗后监测及预后判断等。
由于其标本采集、细针吸取穿刺方法、穿刺器械应用的不同，其制片技术方法和要求也各异。
细针吸取细胞病理学标本原则上仍推荐采用常规手工推片技术，直接将标本均匀涂抹于载玻片上，尽量避免来回推拉标本而导致细胞受损伤。一般不主张采用薄层液基涂片方法。因常规手工推片既可保证细胞涂片较为均匀，细胞保持一定聚集倾向，又能较好反映生活状态下某些病变特征性形态结构，利于诊断。而不像薄层液基涂片细胞单个散在，彼此混合，缺乏结构排列的判断依据。
（八）传统细胞病理学涂片制作的价值和要求
传统细胞病理学涂片是我国临床细胞病理学检查工作中沿用多年的一种制片方法，相对于细胞液基制片，具有自身明显的优点，如操作简单、成本低廉、易学易掌握，可适用于任何条件的实验室，尤适用于基层工作量不大、中小医院或社区医疗机构的细胞病理学实验室。该法涂片细胞较集中，背景及细胞间结构的保存有助于诊断参考，如血性或污秽的背景伴高级别上皮内瘤变常提示浸润可能；腺腔样细胞排列结构有利于腺上皮肿瘤的判断等。
然该制片技术方法存在人为影响大，细胞保存质量参差不齐，可重复性差及重叠现象多等不足，制片过程中需加以关注，以提高质量。
三、细胞病理学标本的固定
细胞病理学标本（涂片）的固定是为防止标本（或涂片后样本）的细胞发生自溶或因细菌作用使细胞发生退变与腐败，并使细胞内各种成分如蛋白质、脂类、糖类或酶类转变为不溶性物质，以保持其细胞原有的结构和相仿的生活状态，从而有利于对细胞形态的观察和细胞性质的判别。固定液和固定方法的选择取决于不同的染色方法，不合适的选择，将直接影响标本的质量。推荐使用染色缸固定，使玻片垂直快速或自由落体进入固定液，以防玻片彼此粘贴堆积，固定液应浸没玻片。大批量涂片可选用相适应的器皿固定。
（一）目前常用的细胞固定方法
1.湿固定法。涂片后立即放入固定液（多主张取样后在数秒内完成为宜），细胞涂片一旦发生干燥现象，会引起细胞肿胀、变形，甚至自溶，导致着色性差、结构模糊，影响细胞的识别。湿固定适用于痰、宫颈、鼻咽、胃肠道和肺支气管等刮、刷片，各种印片细胞学细针吸取及薄层液基制片技术涂片（除浆膜腔积液及脑脊液外）。常适用于Papanicolaou（巴氏）和Hematoxylin‐Eosin（H.E）等常规染色或其他适宜的组化、免疫细胞化学染色检查。
2.潮干固定法。涂片后在空气中放置片刻，蒸发或吸干多余水分。当涂片尚未完全干燥时应及时固定，如尿液、浆膜腔积液及其他液体等离心沉淀物的涂片、乳头溢液涂片等。
上述标本不宜湿固定，否则细胞会高度收缩、深染又易脱落，使用薄层液基制片技术者例外。
3.空气干燥固定法。指涂片置于空气中或在常温下自然干燥或微弱冷风吹干，仅用于瑞氏（Wright）染色及吉姆萨等染色。
4.喷雾固定法。涂片制备后平置，将含乙醇和少量油脂或甲基化合物固定液喷洒于标本上，静待干燥。染色前需放入蒸馏水中浸泡10s。此为湿固定法的一种改良，适用于新鲜制备的涂片。该法气雾剂干燥后可在涂片表面形成一薄层保护膜，故特别适用于邮寄会诊。
然市售气雾剂虽具有效果好、价格低等优点，但不同型号使用方法不同，喷洒距离各异，应严格按说明书操作，以免影响质量。
涂片标本固定时间一般不宜短于15min，原则上应在12h内进行染色处理。
应该指出，传统细胞病理学制作技术原理常为先涂片、后固定，而薄层液基细胞病理学制片方法则采用先固定后涂片的方式，致使标本细胞一定程度的收缩变小，镜下形态也略有差异，在诊断时应加以注意。
（二）常用细胞固定液
1.85%乙醇固定液。每100ml＋冰醋酸1ml，为最常用的固定液，固定时间至少15min以上，也可延至数天并不影响染色效果。该方法适用于湿固定标本或预固定后标本。因乙醇具有溶脂作用，故欲证明胞内含脂质或类脂质时禁用。
2.乙醚、乙醇混合固定液。配制方法是85%乙醇与乙醚之比为1∶1；另一种配制方法为85%乙醇48.5ml＋纯乙醚48.5ml＋冰醋酸1ml混合而成。该固定液渗透性强、固定效果好。缺点为易挥发、有异味，应用时要随时盖紧容器，并严防乙醚靠近火源。适用样本和禁忌同上。
3.Carnoy摧s固定液。由85%乙醇（或无水乙醇）60ml＋氯仿30ml＋冰醋酸10ml混合而成，宜现用现配。适用于固定富含血液的标本，尤适用于显示DNA、RNA、糖原和黏蛋白等的染色，固定3～5min，直至标本褪为无色，然后可转入85%乙醇或其他固定液中。该固定液中冰醋酸能溶解红细胞，也可防止由乙醇引起的高度收缩。另外，固定时间不宜过长，超过15min将影响核着色。
4.甲醇固定液。采用直接滴加于干燥涂片上，适用于吉姆萨（Giemson）染色、瑞氏染色和免疫细胞化学染色，然试剂价格昂贵。
5.50%酒精固定液。为最常用的预固定剂，适用于液体标本的预固定。
6.中性缓冲甲醛溶液。适用于细胞蜡块标本的固定，对于细胞核的结构保存较好。
7.Bouin摧s溶液。1.2%饱和苦味酸溶液750ml＋37%～40%甲醛溶液200ml＋冰醋酸50ml混合，适用于细胞蜡块标本的固定，对于细胞核的结构保存较好。
涂片标本细胞极易脱落，固定时应防止细胞污染，醇类固定液原则上一次性使用，重复使用前必须过滤，多次过滤的固定液（乙醇类）使用前必须用比重计重新调整浓度，方可使用。采用薄层液基细胞学制作的标本，因事先已经固定，涂片无需再行固定程序。
四、细胞病理学检查常用细胞化学染色方法
标本的染色是为了显示细胞结构，增加各种细胞的分辨力。为达到检查的目的，要严格和熟练掌握各种相关染色的性质、特点和操作规程，选择合适的染色方法，以准确识别细胞的特征，为诊断服务。细胞病理学检查中应用的细胞化学的种类及方法有数百种之多，根据实际工作的需要并结合浙江省历年来的工作经验，介绍下述常用的染色方法。
（一）巴氏染色法
巴氏（Papanicolaou，Pap）染色原理与H.E染色基于酸碱度的原理相似，细胞核的主要成分是脱氧核糖核酸，其等电点为pH1.6～2.0。当pH大于2.0时DNA以磷酸基电离为主（带负电），能与带正电的染料阳离子结合。苏木精作为染核的染料，氧化后成为氧化苏木素即苏木红或苏木精，它的等电点是pH6.5，当加入钾矾等媒染剂后，即结合成带强正电的大分子带色体——苏木精矾（即苏木素），后者具有强大的亲合力，与DNA结合牢固，染成较深紫色，不易为醇、水洗脱。细胞浆中的蛋白质等电点约为pH6.0，但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的pH值而改变的。在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电），当pH大于8时便不能再与染料的阴离子结合；在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电），当pH小于4时便不能再与染料的阳离子结合，因此蛋白质在不同的酸碱度中能与不同的染料结合。EA36染液由伊红、亮绿、橘黄及俾麦棕等染料配成。伊红、亮绿、橘黄及俾麦棕等属于酸性染料，在溶媒中其发色团是负离子部分。发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而使胞浆显蓝色、绿色、橘黄或红色。较幼稚的细胞桨（如底层鳞状上皮细胞）中含核蛋白体较多，易与亮绿结合而染绿色；成熟的细胞浆中含核蛋白体较少（如成熟红细胞、表层角化鳞状上皮细胞），易与伊红结合而染红色；衰老的细胞（如完全角化细胞）则可与橘黄结合而呈橘黄色。巴氏染色主要用于妇科涂片、痰涂片和富含鳞状上皮细胞的涂片，在针吸细胞学涂片中也被广泛应用。特点是细胞透明度好，细胞核的结构清晰，胞质色彩丰富而鲜艳。因能显示鳞状上皮不同角化程度，可用于阴道涂片测定激素水平，宫颈涂片内分化差的小角化鳞癌细胞显示橘黄色胞浆，在红色坏死背景中特别突出，不易漏诊，是妇科涂片理想的染色方法。其显着的优点已使之成为宫颈／阴道细胞学检查涂片的国际通用标准染色法。
