就在巴斯德给酿造业带来了福音后，一天，巴斯德的老师杜马来找他，请求他去解决蚕病问题。
法国许多地区的蚕生了一种十分厉害的传染病，使养蚕人蒙受了巨大损失。3500多名蚕业主联名向政府呼吁，要求尽快解决蚕病问题。杜马的家乡阿莱就是受害最严重的地区之一，他不能置乡亲们于水深火热中而不顾，于是他便想到求助于巴斯德。
蚕一窍不通，他并不知道蚕还会生病，甚至还没见过蚕。但他还是答应了杜马：“回忆起您对我种种盛情厚谊，如果不答应您的迫切邀请，我必然会感到后悔莫及。因此我愿听从遵嘱。”出于对师长的遵从和对社会的责任，巴斯德决定马上去阿莱。
在去阿莱之前，巴斯德读了一篇有关蚕业史的文章。文章中谈到了关于蚕的种种传说和蚕业的兴衰：早在四千多年前，中国有一位王后就知道了利用蚕丝，中国人垄断着这种珍贵的虫子，不许带出国境。在大约二千年前，一位公主由于热爱其即将下嫁到中亚的丈夫，便违反禁令将蚕带了出来，此后，蚕从中亚传到了欧洲。
巴斯德很喜欢这个美丽的传说，而更引起他注意的是蚕病的由来：在拿破仑一世时，法国的蚕茧年产量达25000公斤，价值1亿法郎，桑树被称为“黄金树”。可突然这些财富化为乌有，一种神秘的病向蚕宝宝袭来，势不可挡，得病的蚕身上出现黑色或褐色的斑点（所以叫微粒子病），很快死亡，并且传染迅速。1845年人们最初发现这种病，1847年又重新出现，到1849年便泛滥成灾了。1853年，蚕种只得从伦巴第引来，一年后令人失望的蚕病又复发了。这病蔓延到了意大利、西班牙、奥地利……甚至中国也受到了蚕病袭击。到1864年时，只有日本还有健康的蚕种。谁也搞不清这种病是什么原因引起的。
1865年6月，巴斯德接受农业部长委托，带着从不抱怨的夫人、孩子，还有助手来到了阿莱。当地人告诉他许多江湖医方，如用硫磺或木灰粉撒在蚕身上，也有用芥末和蓖麻油的，用灰、煤烟、奎宁、葡萄酒或沥青的，五花八门。巴斯德要先去看一看，当他第一次拿起别人送来检验的蚕茧时，摇了摇，惊奇地说：“这里面有东西。”养蚕人失望了，他们抱怨政府给他们派来了一个如此外行的人。可巴斯德却有信心，他既然来了，就一定要干到底，直至找出神秘的病因。
在一个小小的养蚕所里，巴斯德一安顿下来，就开始了他的工作。
这种蚕病很难捉摸，有的蚕在一龄时病死，有的则在二龄死亡，有的有幸经历了三四次蜕皮做茧成蛹，可出来的蛾却有病，触角畸形，翅膀呈烧焦状，这种蚕蛾产的蚕种，孵不出健康的蚁蚕。微粒子病的发生没有规律，有时突然大爆发，有时又销声匿迹了；有时潜伏于蛹体内，有时看似健康的蛾产下的卵却孵出病蚕。
看到蚕农们绝望的神情，巴斯德深感责任重大，刻不容缓。他马上动手取下病蚕身上的黑斑点，放在显微镜下，全神贯注地搜寻，很快发现了一些球状的小体，“这大概就是病原菌吧？”巴斯德推测着。
就在这时，一个不幸的消息传来：父亲病危。一想到曾经没有见上母亲最后一面的遗憾，巴斯德便心急如焚地赶回老家。可还是晚了，他深爱的父亲已经离开了。巴斯德痛心之极，他说：“30年来，他无时无刻不为我操心，我的一切都归功于他。我年轻时，他严防我交友不慎，他养成我努力工作的好习惯，以身作则教我过最诚实、最充实的生活。他的精神、他的品格远远超过了他的身份和地位。”
匆匆料理完父亲的后事，巴斯德立刻又回到了阿莱。他是一个情感细腻的人，可他完全克制住内心的悲痛，投入到蚕病的研究中。问题很快有了眉目，他认为这种疾病主要在蛹和蛾体内发展，带病原菌的蛾产的蚕种肯定会生微粒子病。
巴斯德决定来年亲自饲养一些蚕来做一下比较研究。他安慰那些失去信心的蚕业主们：“不要着急。”其实他的心里比谁都急。
1866年的春天来了，巴斯德的实验正在顺利进行，可不幸的是他的女儿塞西尔得了一场伤寒，他已接连失去了两个女儿，实在无法再接受一次打击了。可没办法，一面是心爱的女儿，一面是濒临毁灭的养蚕业，在女儿病重的两个多月里，他只陪伴了她两三天，其余的时间始终没离开他的蚕。塞西尔没等到爸爸赶回来再看她一眼便走了，巴斯德怀着内疚为女儿做了最后一件事，亲自把她的小棺木送回老家，葬在她祖父母和两个姐妹的身旁。
“我现在沉浸在工作中，只有工作才能使我忘却无限的悲痛。我回到巴黎后，将向蚕业委员会提出切实可行的办法，并在几年内消灭这一疾病。”他把失去亲人的痛苦深深地埋在心里，而把对人民、对事业的爱表现在行动上。
他终于有了办法：升高温度加速一些蛹发育成蛾，然后把蛾隔离开来，让雌蛾把卵产在一块布上，然后就把蛾钉死在这块布上，再将已干瘪的死蛾研碎放在显微镜下观察，发现了病原菌则把死蛾及其产的卵连同布块一起烧掉，若没有病原菌则可以放心地留作蚕种。
“1867年一定是人们听到蚕业主抱怨声的最后一年。”巴斯德信心十足地预言。1867年1月，巴斯德又来到阿莱，他开始实施自己的办法，选出了健康蚕和病蚕，每天饲养观察。此外，他还喜欢去附近其他的养蚕室看看。他看到一户养了一窝健康的蚕，可在这窝蚕的上方养了窝有病的蚕，没几天，健康的蚕也染上了病。巴斯德认定是病蚕的排泄物落了下来，感染了健康的蚕，微粒病的传染途径是直接接触或是饲料受病蚕排泄物的污染。
正当巴斯德自认为已解决了蚕病问题时，突然，他饲养的一窝健康的蚕，在第一次蜕皮后，大批死亡，死蚕身体发黑，软而松，烂得很快，可检查时又找不到一点微粒子病的病原菌，巴斯德茫然了，难道显微镜下看到的小球体不是病原菌？
有些贩卖蚕种的商人，由于巴斯德的检疫法使他们个人的利益受到了损失，这时也开始造谣中伤了。他们说巴斯德的办法完全失败了，阿莱人异常愤慨，巴斯德被迫逃离阿莱，人们追逐他，向他扔石块。
挫折没有动摇巴斯德的决心，他聚精会神于蚕病研究，不想别的，不谈别的，精心饲养他的蚕，每天比辛勤的蚕农起得还要早。他的助手杰内斯说：他实验中总是亲自动手，连细枝末节也不放过。他除了要忍受年轻力壮的人才能忍受的疲劳外，还经常受到不速之客的打扰，为不期而来的批评指责而分心。
与此同时，巴斯德还在为建立一所一流的实验室而奔走。他列举了德国、英国、美国、奥地利、意大利等国家重视科学发展、重视实验室建设的事实，以及法国科学家还在最简陋的环境中工作的现状，写了一篇言词犀利的文章，抨击当时的法国政府。幸好拿破仑三世是个热爱科学的开明君主，他邀请巴斯德等人共商此事，终于同意改善科研条件，拨下专款筹建实验室。
巴斯德在阿莱的研究取得了最后的成功，他搞清了蚕体发软变黑腐烂的病为软化病，也是由病原菌引起的，其病原菌为弧状。他一边总结这些成果，一边督促实验大楼尽早开工，当然还要随时应付对手们的非难。
过度的劳累，使这位不知疲倦的人身体吃不消了。1868年10月的一天，巴斯德突然觉得身子左边有一种针刺般麻木，可他还是要坚持参加研究院的会议，巴斯德夫人只好陪他来到科学院，她请求巴拉尔会后送巴斯德回家。巴斯德夫人所担心的事终于发生了，晚饭后，巴斯德突发脑溢血，左半身瘫痪。
朋友们纷纷来看望他，他对大家说：“我不甘心死去，我还要为祖国做更多的工作。”病情惊动了皇帝，皇帝、皇后每天上午派人来询问病情，所有的人都为他担心。杰内斯更是焦急万分，整整一周几乎寸步不离。而巴斯德本人却很平静，他的头脑完全清醒。由他口授，杰内斯记录，写了一篇关于检验发现早期蚕软化病的方法的报告送交了研究院。同事们无不为之感叹，实在难以想象一个垂危的患中风病才一周的病人，竟能如此忘我地工作。他人在病榻上，可心还在阿莱的育蚕室里。
一个多月后，巴斯德可以坐起来了，他的思维像从前一样活跃，他谈科学、教育，以及明年的蚕种……而唯独不谈自己的病，他不想让别人为他的病而担忧。这是多么感人的一幕啊，热烈而高尚的思想境界与半身不遂的病之间形成了强烈的反差，目睹这一切，每一个人都会为之动容。
1868年12月底，巴斯德能独立行走几步了。快到选育蚕种的季节了，他顾不得医生让他再休息几个月的劝告，一定要到阿莱去。他说为了个人的健康让那么多遭受苦难的人破产，这简直是犯罪。他是躺在马车上去阿莱的。
大量的实践表明，用显微镜检查微粒子病和软化病的病原菌的技术既好掌握又十分有效。1869年春，巴斯德向蚕业委员会提供了一批保证健康的蚕种，此外，为了证明他的检验方法的准确性，他还提供了另外几份做对比的蚕种，写上了预期的结果：1.一份是健康的蚕种。
2.一份是将患微粒子病而死亡的蚕种。
3.一份是将患软化病而死亡的蚕种。
4.一份是部分将患微粒子病，部分将患软化病的蚕种。
巴斯德的方法完全成功了，他的预言百分之百的正确。正当他以为大功已经告成时，一些心怀嫉妒的同行，早有隔阂的对手，一些受到经济损失的见利忘义的蚕种商人，又开始对巴斯德大肆中伤。可真理毕竟是诋毁不了的，一位蚕农给《农业实践新闻》写信：“我们深切地希望，有一天他一定会收获他那艰巨劳动的果实，以补偿他目前所受的猛烈攻击。”阿莱市长也表示：“只有在阿莱为你树立一尊铜像才能报答你的业绩。”
巴斯德的老朋友瓦扬元帅，想了一个很好的主意：皇太子有宗地产，叫维桑蒂纳别墅，在这片广阔的庄园里，桑树繁茂。瓦扬向皇帝建议请巴斯德为这里送些健康的蚕种，并为巴斯德在附近准备了一幢舒适漂亮的别墅。他说这样既有利于巴斯德的健康，又可以让出于无知和嫉妒的反对言论销声匿迹。
巴斯德来到这个庄园，将蚕种分给庄园领地的佃户，可是万万没有想到，别墅里有一个家人，他有一盒多年的日本蚕种，他把这盒靠不住的蚕种与健康的蚕种混在一起出售了。巴斯德知道后，怒不可遏，他痛斥了家人一顿，并登报澄清真相，告诉养蚕人别上当。这一年，巴斯德使这个多年荒芜的庄园获纯利22000法郎，这使得皇帝又惊又喜。
