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[24]王乙忠，等.扶正抑瘤冲剂配合化疗治疗微小残留白血病的临床与实验研究.中医杂志，1996；37（9）︰535.
天蓝苜蓿对AL体外药敏试验研究
天蓝苜蓿为豆科苜蓿属植物天蓝苜蓿MedicagolupulinaL.，以全草入药，性味甘、微涩、平，具有清热利湿、凉血止血、舒筋活络之功效。本研究以天蓝苜蓿水煎浓缩液为试验药品，以急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞及急性非淋巴细胞白血病（ANLL）细胞为受试细胞，应用细胞染色法进行天蓝苜蓿对人ALL细胞及ANLL细胞体外药敏试验，以证实天蓝苜蓿对ALL细胞及ANLL细胞有无抑制作用。现将结果总结报告如下。
1材料
1.1天蓝苜宿
中药回生汤系列治疗白血病课题组提供，采自东径106°45′与北纬35°10′的宁县焦村乡西里村。兰州医学院药学系赵汝能教授鉴定。
1.2天蓝苜蓿浓缩液的制备
取天蓝苜蓿全草干品200g，加水2000ml，煎煮30分钟，滤出药液，另加水2000ml煎煮30分钟，滤出药液。将两次滤出药液混合，加热浓缩至1000ml，即为200mg/ml天蓝苜蓿浓缩液，密封、灌装，消毒后供试验用。
1.3RPMI—1640培养基
美国Sigma公司生产，按常规配制，无菌吸滤、分装。
1.4受试细胞
在庆阳市中医医院不同时期住院病人中选择按FAB标准确诊的ALL病人3例，分别为L1、L2、L3，ANLL病人3例，分别为M1、M2、M5a，在未经任何治疗前，常规静脉采血5ml，加肝素抗凝（50u/ml）混匀，室温放置2小时，吸取白细胞层与无菌1640培养基混匀，分别制成L1、L2、L3细胞及M1、M2、M5a细胞悬液，并在各细胞悬液中加入青霉素100u/ml、链霉素100ug/ml（均为最终浓度）。做白细胞计数，并用RPMI—1640培养基调整细胞数到10×109/L及10×106/L，备用。
1.5实验条件
在位于甘肃省庆阳市中医医院的国家中医药管理局中医药科研实验室——血液病一级实验室内完成实验全过程。
2方法
，2.1用RPMI—1640培养基将天蓝苜蓿浓缩液（200mg/ml）分别稀释成50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6mg/ml、3mg/ml五种不同浓度的天蓝苜蓿药液及20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml四种不同浓度的天蓝苜蓿药液。
2.2分别将L1、L2、L3细胞悬液（浓度为10×109/L个细胞）分别加入18支试管，每管0.9ml，分成六组，每组3管。第一组3支试管分别加入0.1ml、50mg/ml的天蓝苜蓿浓缩液；第二组3支试管分别加入0.1ml、25mg/ml的天蓝苜蓿浓缩液；第三组3支试管分别加入0.1ml、12.5mg/ml的天蓝苜蓿浓缩液；第四组3支试管分别加入0.1mg6mg/ml的天蓝苜蓿浓缩液；第五组3支试管分别加入0.1ml3mg/ml的天蓝苜蓿浓缩液；第六组3支试管分别加入0.1ml生理盐水（NS）？。这样使天蓝苜蓿药物最终浓度分别为：5.0mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.6mg/ml、0.3mg/ml及0mg/ml。橡皮塞塞紧管口，试管倾斜15度，放置37℃培养箱培养4小时。
2.3分别将M1、M2、M5a细胞悬液（浓度为10×106/L个细胞）分别加入15支试管，每管0.9ml，分成五组，每组3管。第一组3支试管分别加入0.1ml、20mg/ml的天蓝苜蓿浓缩液；第二组3支试管分别加入0.1ml、10mg/ml的天蓝苜蓿浓缩液；第三组3支试管分别加入0.1ml、5mg/ml的天蓝苜蓿浓缩液；第四组3支试管分别加入0.1ml、2.5mg/ml的天蓝苜蓿浓缩液；第五组3支试管分别加入0.1ml生理盐水（NS）。这样使天蓝苜蓿药物最终浓度分别为2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml及0mg/ml。橡皮塞塞紧管口，试管倾斜15度，37℃培养箱培养4小时。
2.4轻轻混匀试管内细胞，每管滴加0.2%伊红水溶液2滴，混匀后立即滴入细胞计数盘内，做总的白细胞计数及被染色细胞计数。
2.5杀死细胞百分率用如下公式计算：
四个大方格内被染色白细胞
杀死细胞百分率＝，×100%
四个大方格内白细胞总数
2.6计算出每组3管的平均值。
3结果
天蓝苜蓿浓缩液对L1、L2、L3细胞均有明显的杀伤作用。其中5.0mg/ml组对L1、L2、L34小时培养杀死细胞百分率均在90%以上；0.3mg/ml组对L1、0.6mg/ml组对L2的杀死细胞百分率均在50%以上；0.6mg/ml组对L3杀死细胞百分率在60%以上，NS组有3%～10.1%的淋巴白血病细胞被杀死，可能与ALL细胞自身死亡率较高有关。
从表2可见：天蓝苜蓿浓缩液对M1、M2、M5a细胞均有显著的杀伤作用。其中2.0mg/ml及1.0mg/ml组对M1、M24小时培养杀死细胞百分率均在90%以上；0.25mg/ml组对M1、M2及M5a杀死细胞百分率均在50%以上。以上四组与NS组比较，P＜0.001，有非常显著性差异。表明天蓝苜蓿用药浓度大于0.25mg/ml时，其杀伤作用便非常显著。
4讨论
实验结果表明：天蓝苜蓿在0.3～0.6mg/ml浓度范围时，即可对ALL细胞有50%以上的杀伤作用。提示天蓝苜蓿具有明显的抑制ALL细胞作用，抑制作用强弱依次为L1、L3、L2。在浓度大于0.25mg/ml时对ANLL细胞具有较强的抑制作用，抑制作用强弱依次为M2、M1、M5a。为天蓝苜蓿治疗急性白血病提供了科学依据。
（2004年在成县召开的甘肃省中医药学会学术研讨会议上大会交流，与张鑫智、谢君国、开金龙、姚金华、俄静合作。实验在国家中医药管理局血液病一级实验室——庆阳市中医医院血液病研究室完成）
回生丸I号小鼠急性毒性试验报告
1摘要
受试药物为中药制剂丸药，本试验用超纯水将原丸药溶解选小鼠经口给药，以最高耐受剂量（相当于人临床用量的6倍）染毒，观察毒性反应特点，结果观察染毒几分钟后出现全身症状，二周内未见死亡，未发现其它症状，处死后尸解未见异常，小鼠经口LD50>；30g/Kg。
2试验目的
观察受试物一次给予动物后所出现的急性毒性反应和死亡情况，为以后的科研和长期毒性实验提供依据。
3受试药物
3.1名称中药回生丸I号。
3.2提供单位甘肃省庆阳市中医医院。
3.3含量每丸重9克，含生药3.25克。
3.4配置方法原丸药加超纯水成混合悬液。
3.5溶剂超纯水。
4动物
4.1来源北京医科大学实验动物部，昆明种，经检疫观察为健康动物，合格证：医动字01—3049。
4.2体重，18～20g。
4.3性别雌雄各半。
4.4禁食时间，8小时以上。
4.5每组动物数10只。
5剂量
5.1剂量设置
人临床用量口服每天2次，每次2丸，相当于0.6g/Kg，本实验采用最高耐受剂量给小鼠染毒，为30g/Kg，相当于人临床用量的6倍。
5.2每只动物接受容量
每只动物给药量为0.5ml/10g，4小时内分两次给予。
6给药途径
根据临床拟用途径为口服，本实验采用经口灌胃给药。
7方法和观察期
经口灌胃后观察毒性反应症状和死亡情况，观察2周。
8结果
给药5分钟左右可见全身出汗症状，未见其它毒性反应，2周内未见死亡，处死后尸检未见异常。小鼠经口LD50大于本实验条件最高耐受量30g/Kg（此剂量相当于人临床用量的6倍）。
9判定于本实验条件下未发现毒性反应。
试验设计和负责人高广华（讲师）
试验者贾凤兰（主管技师）尚兰琴（主管技师）
试验日期1996年10月
原始资料保存处北京医科大学毒理学教研室
，联系人高广华，电话010–62091628
，
回生丸I号抗急性白血病实验研究
回生丸I号是甘肃省庆阳市中医医院院研制的治疗急性白血病的纯中药制剂，具有清热解毒、活血化瘀、化痰散结之功效，经近10年来临床应用疗效显著。为进一步探讨其对急性白血病的作用机制，我们进行了主要药效学实验，现报告如下。
1材料
1．1回生丸I号，
甘肃省庆阳市中医医院制剂室提供，每丸重9g，含生药材3.25g，批号：970218。实验时将原药加超纯水制成混悬液。
1．2动物，
昆明种小鼠，北京医科大学实验动物部提供；BALB／C近交系小鼠、615近交系小鼠、NH小鼠均由中国医学科学院肿瘤医院提供。
1.3细胞株
L615小鼠淋巴细胞白血病细胞株，中国医学科学院血液病研究所提供；H22小鼠肝癌细胞株，中日友好临床医学研究所提供。
1．4仪器
流式细胞仪，美国库尔特公司产品，中日友好临床医学研究所提供；T细胞单克隆抗体，美国GBICOA公司产品。
2方法
2．1对小鼠H22肝癌细胞的抑制实验，
NH小鼠，体重20～22g，每批实验性别相同。每只小鼠腋下接种H22肝癌细胞3×105个，同时开始灌药，每次0.2mL，每日2次，共10天，于第ll天将小鼠脱颈处死，完整地分离出肿瘤组织，用天平称重。对照组用生理盐水灌胃。
2．2对L615小鼠淋巴细胞白血病细胞的抑制实验
615小鼠，体重20～22g，预先灌药5天，于第6天接种L615小鼠淋巴细胞白血病细胞l×l04个，观察生存时间．对照组用生理盐水灌胃。
2.3对小鼠T淋巴细胞亚群作用实验
BALB／C小鼠，体重20～22g，每只小鼠腹腔下注射环磷酰胺0.2mg／g体重，用中药灌胃，每次0.2ml，每日2次，共l0天。第11天小鼠眼球取血，抗疑，分别加入单克隆抗体（CD3、CD4、CD8），孵育。加入1％草酸铵液溶解红细胞，PBS洗涤1次，离心取上清液调整细胞浓度，用流式细胞仪检测。阴性对照用生理盐水灌胃，正常对照组小鼠不作任何处理。检测同时作血常规检测和白细胞分类，计算淋巴细胞绝对值和各类T淋巴细胞绝对值。
4讨论
，回生丸I号可在体内有效抑制某些肿瘤细胞的生长，如H22肝癌细胞和L615淋巴细胞白血病细胞。并通过增加T淋巴细胞亚群的活性而使实验动物的免疫功能得到提高。，
回生汤系列配合化疗治疗AL76例临床观察
，回生汤系列是我院治疗血液系统恶性肿瘤的经验方。自1991年3月～1996年9月，笔者采用该系列方配合化疗治疗急性白血病76例，并与单纯化疗的30例进行对照，取得了较好的临床疗效，现将结果报道如下。
1临床资料
所有病例均为我院及甘肃省人民医院住院病人，均经临床、血象、骨髓象及组织化学染色确诊，随机分为治疗组（中药加化疗）和对照组（单纯化疗）。治疗组76例，男48例，女28例；年龄10～71岁，平均（25.8±6.2）岁；按FAB协作组提出的诊断标准[1]，急性淋巴细胞白血病（ALL）26例（其中L112例，L2ll例，L33例），急性非淋巴细胞白血病（ANLL）49例（其中M15例，M220例，M31例，M46例，M5l6例，M61例），慢性粒细胞白血病急粒变1例；病程15～185ld，中位数202d；初治42例，复治34例；中医辨证分型：邪毒炽盛、痰瘀互结型18例，邪毒渐退、气阴两虚型31例，气血不足、阴阳两虚型17例。对照组30例，男20例，女10例；年龄12～70岁，平均（33.7±5.8）岁；按FAB分型，ALLll例（其中L13例，L26例，L32例），ANLL18例（其中M11例，M26例，M45例，M56例），慢性粒细胞白血病急粒变1例；病程20～600d，中位数106.5d；初治18例，复治12例。
2治疗方法
，治疗组和对照组自确诊后即开始用标准化疗方案联合化疗，其ALL中18例用VP（长春新碱、强的松）方案，19例用VDP（长春新碱、柔红霉素、强的松）方案：ANLL中除1 例M3服用全反式维甲酸（ATRA）之外，34例用DA（柔红霉素、阿糖胞苷）方案，22例用HOAP（高三尖杉酯碱、长春新碱、阿糖胞苷、强的松）方案，12例用HA（高三尖杉酯碱、阿糖胞苷）方案。并发中枢神经系统浸润者用MTX（氨甲喋呤）加Dex（地塞米松）鞘内注射，每周2次，用至正常为止。诱导缓解之后，均用原方案强化1～2疗程，再更换其它方案巩固治疗。
，治疗组化疗同时加中药治疗，以回生汤（天蓝苜蓿、墓头回各30g，龙葵20g，紫河车粉3g）为主方，并随证加味。邪毒炽盛、痰瘀互结型加虎杖、半枝莲、白花蛇舌草、仙鹤草各20g，夏枯草、白茅根各15g，赤芍l0g，炙鳖甲（先煎）15g，青黛（冲服）3g；邪毒渐退、气阴两虚型加太子参、当归、黄芪各20g，女贞子、旱莲草、半枝莲、白花蛇舌草各15g，生地黄、茯苓、白术各10g；气血不足、阴阳两虚型加党参、当归、黄芪、熟地黄、补骨脂、鸡血藤各20g，山茱萸、菟丝子、土茯苓各15g，阿胶（烊化兑服）l0g。中药每日1剂，水煎服，1个月为一疗程。达完全缓解之后再根据中医辨证分型施治，需长期服药者可将原汤剂缩为丸剂或胶囊剂服用。
3结果
3.1疗效标准
按1987年全国白血病化学治疗讨论会“急性白血病疗效标准”[2]，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、未缓解（NR）。
3.2总疗效
治疗组76例中，CR51例（67.1％），PR10例（13.2％），NR15例（19.7％），缓解率（CR+PR）为80.3％。对照组30例中，CR13例（43.3％），PR8例（26.7％），NR9例（30％），缓解率70.0％。两组CR率比较，有非常显著性差异（P<；0.001）；缓解率比较，无显著性差异（P>；0.05）。
3.3治疗组对不同类型急性白血病疗效
，治疗组26例ALL中，CR17例（65.4％），PR5例（19.2％），缓解率84.6％；49例ANLL中，CR34例（68.0％），PR5例（10.0％），缓解率78.0％。两者CR率及缓解率比较，无显著性差异（均P>；0.05）。按中医辨证分型，分型间症候改善情况亦无显著性差异（P均>；0.05）。
3.4CR时间
，治疗组51例CR时间为22～122d，平均（46.68士29）d；对照组13例CR时间为30～90d，平均（61.46±19.89）d。二者比较，有显著性差异（P<；0.05）。
