1506年5月，达·芬奇二度来到米兰。他是以请假的办法离开佛罗伦萨的。假期原是三个月，但经过法兰西国王和他的米兰总督查理·达·安波斯的说情，佛罗伦萨执政府准许达·芬奇无限期请假。第二年，即1507年，达·芬奇应法国国王路易十二的聘请，正式任米兰宫廷画家和技师。他便搬到米兰长住下来，偶然有事情才去佛罗伦萨走一趟。
作为宫廷技师，达·芬奇仍然作一些水利工程的设计工作。同时，他还为法国总督布置米兰要塞工事，建筑营寨，以防德伦巴第人的进攻，就像当年他替米兰公爵斯福查布置工事以防备法国人进攻一样。也为法国人搭凯旋门，这些材料同样也为斯福查用过。政治是达·芬奇从来不感兴趣的，他只是对他的工作本身感兴趣。
在从事这些工程技术之作之处，达·芬奇仍然没有中止他的艺术创作。大约在1506年间，他创作了油画《丽达和天鹅》。这幅画取材于希腊神话故事。丽达是一位仙女，她孤身一人居住在一个荒岛上。这里风景优美，但是人迹罕至，她感到非常孤独、寂寞。排遣寂寞的惟一办法，就是躺在绿阴之下，仰天观云。看云飞云散，变幻莫测，觉得自得其乐。一天，她看到天边突然飞来一朵闪光的祥云，落到面前，原来是一只晶莹洁白的天鹅。这是一只优美、健壮的天鹅。它走向丽达，依偎着她。丽达也非常喜欢这只天鹅。可是，这位少女当时怎么也想不到，这只天鹅是宙斯变的。
后来他们相爱，丽达怀孕生下了一个大鹅蛋，破壳而出的是两个男孩。达·芬奇画中描绘的是丽达和天鹅相会的情景。
画中背景是蓝天下的河流湖泊，群山环绕，画的右边是一株大树。前景是裸体的丽达和矫健的天鹅。丽达带着少女初恋时的喜悦和羞怯，她的裸体展示了青春的美丽和生命力。画面左下角有一对白胖的幼儿在天真嬉戏，抢夺手中的鲜花。整个画面生机勃勃，情趣盎然。它表达了艺术家对自然的赞美，对追求爱与美的美好人生的颂扬。
“丽达与天鹅”是西方古代神奇的爱情故事中为人们所喜爱与传颂的一个。众神之王宙斯由于地位至高无上而目空一切，生活作风自由而放荡，他为了追求爱情的满足不知变幻过多少形象而与神间、人间的美丽女子相爱。现在他又爱上了仙女丽达。丽达生活在美丽的海岛上，她那绝代之美放射出灿烂的光辉，这使宙斯在奥林匹斯山上情火燃烧，坐立不安，但是天后赫拉对他看管极严，使他无法脱身，最后他巧妙地摆脱了妻子的监视，摇身一变成为天鹅，飞落在丽达的身边。天真的丽达根本不知道这是宙斯的化身，十分喜欢这只雄健温顺的大天鹅，他们俩成了形影相随的亲密朋友。
文艺复兴时期，人们从否定人性的中世纪桎梏下醒悟过来，大胆地追求人类之爱与个性解放，画家给这一神话传说赋予了新的时代精神。画家们争相描绘古希腊的情爱神话故事，借以表达自己的情感和审美理想。
希腊人创造了这一美好的神话，表达了古代人们对爱的渴望与追求。人类的延续正是爱情的结果，这故事的产生表明希腊人对人类这一本性的肯定和赞颂。达·芬奇在1504年到1506年间至少完成了三幅《丽达与天鹅》的构图。达·芬奇的画可以从两个方面看，一是从科学家的角度看芬奇是如何利用画来表明自己的科学见解的；二是从艺术家的角度看他是如何通过艺术形象传达情感的。根据达·芬奇没有受到古典神话的感动，对新柏拉图主义也不怎么关心，尤其是在感情上或肉欲上，女人对他没有什么吸引力。这正是决定他创作动机的因素。既然女人引不起他的欲望，他对传宗接代的神秘性当然就愈发好奇了，这就激起他对人类的繁殖现象进行研究的欲望，所以在他的艺术中包含着科学探索的一面。
人们曾发现”丽达”一画是作为他研究人的生殖过程中的草图，至少他只想把这幅画作为生殖的意象或寓言。在达·芬奇的有关《丽达与天鹅》的三幅构图中，立体形象基本上是相同的，只是配置了不相同的环境。
比如，其中的一幅是这样的：在一片宁静的散满奇花异草的山水间，一位裸露玉体似仙似人的女子，婀娜多姿地面含羞涩的微笑，在和一只巨大的天鹅玩耍，足边两个小天使摘取一束鲜花，奉献于这女子——女神丽达。画家特意将丽达画得“顶天立地”，依偎着求爱的天鹅，含情脉脉，显示出一个少女的腼腆。少女搂抱着天鹅的颈项，曲伸的鹅头欲与仙女亲吻。天鹅张开强有力的右翅，温柔地拢抱着少女那令人失魂的玉体，很有节制地献上爱的深情。
大自然在为他们的幸福微笑，小鸟也在为他们相爱而歌唱，鲜花为他们盛开，自然充满更新的生机，这是获得新生时代的赞歌，对人类性爱的颂扬。达·芬奇着力于描绘爱的柔情蜜意，在人物与天鹅的造型上，强调曲线的构成。我们从丽达的身姿上不难看出普列特西克里斯的S形优美造型的光辉，其雕刻般的造型结构，充分利用面的转折以使主体人物形象丰富：丽达下身呈正面，上身侧转，这种变化使直立单调的体形顿觉丰富。达·芬奇在造型处理上为了充分表达温柔与智慧之美，采取明暗渐进的处理法，这是他从画鸡蛋的明暗法中悟出的真谛。光芒照在丽达身上变化柔和，这适合于女子人体圆浑丰满的造型，明暗色调变化层次也极为丰富。不太过分的受光面是主调，最暗处放在明与暗交界处，这种形体处理产生了强烈的立体感、真实空间感，有一种雕塑般的效果，柔中有力。但画家尚未做到色彩的微妙变化，但却十分讲究大块的热冷对比关系，人物用热色主宰，而大面积的背景却以冷暗色调相衬，这就使人体更鲜明突出。达·芬奇在背景的描绘上赋予了自然以生机，细致地描绘了繁多的自然物，各种不同的花草树木、桥梁、建筑，既显示了神的奥秘境界又反映了人的生活环境。画家把对人的赞美、对自然的赞美融于一画。达·芬奇在他的艺术创作中，渴望探知人类灵魂和肉体的奥秘。并把这种探求再现于人们的视觉之中；他企图对自然的伟大进行悉心研究并把它的美再现于人们的眼前。他做到了，比任何人做得都好，尽善尽美。
渴望是甜蜜的，但满足却是痛苦的，“完美的天赋必然伴随着巨大的痛苦”。对于达·芬奇这样一位艺术大师而言，尤其如此。创造美的能力越大，感受痛苦的敏感益甚。这位艺术大师之所以成就卓著，那是因为他备受磨难。古希腊诗人有一个观念，它建立在对生活的深刻理解之上。那就是“磨难出智慧”——正是因为我们能吃苦，所以我们才能创造。与此同时，达·芬奇还设计伦巴底的征服者、法国元帅特里乌尔齐奥的骑马纪念碑。他采用前足跳起，后足站立的马的构图。从他的弟子们所作的青铜模型来看，这一构图具有强烈的运动感与表现力。
达·芬奇这期间创作的比较重要的油画是《圣安娜》和《施洗约翰》。油画《圣安娜》与1501年的素描《圣安娜》构图大致相似。但施洗小约翰被取消了，玛利亚坐在她母亲的膝上，圣安娜以微笑注视耶稣，耶稣则企图骑在羔羊的身上。圣安娜好像永远是年轻的古代女先如。她的下垂的眼睛和微颤的嘴唇之间露出笑容，是神秘而慈爱的。玛利亚在母亲的身上，表现出孩子般的天真。画面上仍然洋溢着圣家族生活的天伦之乐。
但是，与素描比较起来，圣安娜与玛利亚脸上的笑容丧失了它以前的深刻的表现力。而且整体上，也不如素描自然生动，富有诗意。
《施洗约翰》中画的约翰，一只手擎着十字架，另一只手指向天空。他面带微笑，头发很长，气质上带有女性的温柔。这种微笑，表明达·芬奇的创作已有定型化的倾向。这标志着达·芬进入老年，他的艺术创作的才华，正在逐渐减退。
然而，已近暮年的达·芬奇，在1512年作的素描《自画像》，给他一生的艺术创作生涯划了一个辉煌的句号。
从现在传世的作品和资料来看，《自画像》大约是达·芬奇的封笔之作，画上的达·芬奇蓄着浓密的长须，目光深邃、犀利，额头和眼角皱纹纵横，显出阅尽人间沧桑的经历和丰富的智慧，端直的鼻子下面，嘴角刚毅而有力。他的脸上流露出沉思和仿佛痛苦的表情，揭示他的全部的个人命运，也烙下了那个时代的印记。
素描运用的是红炭笔，线条流畅、有力，具有激动人心的表现力。它没有为细节淹没，也没有回避细节，而是详尽无遗地表现了人物的本质特征。线条不仅仅描绘这一形象的轮廓，还具有一定的空间立体品质，创造了生动的造型体积感受，达到浮雕式的造型效果。有人曾这样评论：“人们从这幅自画像里，可以看出巨匠的思考力、智慧和性格的特征。人们可以看到具有坚强不屈的意志的鼻梁和嘴唇，洞察一切事物的敏锐而深刻的眼睛。波浪式的长发联结着下须，掩盖着深思而庄严的脸，给人留下一个具有无限生命力的伟大师匠的印象。”
此时，达·芬奇的主要精力和时间投入在数学、生理学和解剖学等科学研究中。
达·芬奇第一次住在米兰替穆罗办事时，很勤勉研究解剖学；同他一起研究的，还有个很年轻的科学家，马可·安东尼阿，那时只有18岁，但已经是个有名的学者了。马可·安东尼阿是卫隆那旧世家德拉·托勒族出身，这一族人历来都爱研究学问；他的父亲在巴杜亚大学教医学，他的几个哥哥也是学者。他差不多还是一个小孩子时，意大利两个有名的大学，巴杜亚大学和巴维亚大学，都争着聘用他，达·芬奇回到米兰之前，马可·安东尼阿也才25岁，但已经是全欧洲第一等的学者了。
这两个人研究学问的方向似乎是一致的：都舍弃中古阿拉伯人那种经院式的解剖学而代之以实验和观察，代之以精密研究活体的构造。但在表面相同之下，却藏有深刻的差异。
