经注射催产剂后的亲泥鳅可放在产卵池或网箱中进行自然交配受精。将预先洗净消毒扎把的鱼巢布设在产卵池或网箱中。一般网箱规格为2米×1米×0.5米（长×宽×高），每只网箱放亲鳅50组。
雌、雄泥鳅在未发情之前，静卧产卵池或网箱底部，少数上下窜动。接近发情时，雌、雄泥鳅以头部互相摩擦、呼吸急促，表现为鳃部迅速开合，也有以身体互相轻擦的。雌鳅逐渐游到水面，雄鳅跟上追逐到水面，并进行肠呼吸，从肛门排出气泡。当一组开始追逐，便引发几组追逐起来。如此反复几次追逐，发情渐达高潮。当临近产卵时，雄鳅会卷住雌鳅躯体，雌鳅产卵、雄鳅排精。这时雄鳅结束卷曲动作，雌、雄泥鳅暂时分别潜入水底。稍停后，开始再追逐，雄鳅再次卷住雌鳅，雌鳅再次产卵、雄鳅排精。这种动作要反复进行10～12次之多，体形大的次数可能会更多。由于雌、雄泥鳅成熟度、个体差异以及催产剂效应作用的快慢不同，同一批亲泥鳅的这种卷体排卵动作之间间隔时间有长有短。例如，在水温25℃时，有些泥鳅两次卷体时间间隔2小时20分钟之久，有的间隔为20分钟，时间间隔短的仅10分钟左右。
每尾雌泥鳅一个产卵期共可产卵3000～5000粒。卵分多次产出，一般每次产200～300粒。受精卵附着在鱼巢上，如鱼巢上附着的卵较多时，应及时取出，换进新的鱼巢。泥鳅卵的黏性较差，附着能力弱，容易脱落。产卵池中的鱼巢下可设置可浮性纱框，承接落下的受精卵，以便提高孵化率。产卵结束后，将亲泥鳅全部捞出，受精卵在原池或原网箱或其他地方孵化，避免亲泥鳅吞食受精卵。
