（三）申请电镜检查的基本手续及有关的诊断报告
1.申请电镜检查的人员应预先到电镜室咨询有关检查的必要性及标本处理方法等事项。
2.确定需要电镜检查后，申请人应认真填写电镜申请单，内容包括：①患者的基本信息及临床资料要点；②进行电镜检查的目的、要求；③患者有关病变组织病理学检查的结果；④送检标本的部位、数量、时间、固定剂的种类和方式等。
3.电镜室人员应向检查人员介绍取材要求，并与送检方人员认真核对送检样本和申请单，核实无误后方可接受电镜检查的申请。
4.电镜室应尽快完成样本的制备检查，由具有独立超微病理诊断资格的专业人员进行电镜观察并签发电镜诊断报告。
（四）电镜室管理常规
1.一般管理
（1）临床各科室及院外单位根据电镜检查的需要，由医师或有关人员到电镜室对电镜检查的必要性及标本处理等进行咨询。
（2）确定需进行电镜检查后，填写申请单。申请单分透射电镜和扫描电镜两种，要注明检查目的。需进行电镜诊断的病例应详尽填写病人有关的病史及重要的临床信息、组织病理学检查结果等。
（3）电镜室有责任向送检人员介绍具体取材要求，并提供与标本固定有关的试剂。
（4）送检材料必须附上电镜检查申请单，注明脏器名称、部位、检查内容、取材与固定时间、所用固定剂的种类及固定方式（灌注或浸泡）以及固定持续时间等。
（5）安排制样及标本观察时间。除训练有素的送检人员可在电镜室专业人员指导下进行独立观察外，一般标本应由电镜室工作人员制样和观察，并发出电镜报告。
（6）对需要长期进行电镜制样及观察者，电镜室负责定期进行技术培训。
2.档案管理
（1）标本档案
①存档文件包括电镜申请单、制样记录、底片、照片、观察内容及结论等。
②文件可按基础研究的内容、临床各科室病种及研究对象进行分类，也可按标本号顺序排列保存。
③提供借阅服务。
④为首次来室进行电镜检查咨询人员提供参考。
（2）仪器及试剂档案
①仪器档案包括各仪器运转情况、维修记录及零配件的库存情况。
②贵重及剧毒药品的保管。
免疫组织化学技术
一、免疫组织化学基本原理
免疫组织化学或细胞化学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科，以免疫学的抗原抗体反应为其理论基础。其原理为用特异性的抗体去探测组织或细胞中的抗原物质，并于原位形成抗原抗体复合物，再借助组织化学方法将无色的抗原抗体反应部位显示出来，达到对组织或细胞未知抗原的定性、定量、定位的研究。
二、免疫组织化学染色前的准备工作
（一）基本设备
冰箱、恒温箱、微波炉、电饭煲、可调式移液器、湿盒等。
（二）组织切片和细胞涂片、培养的细胞爬片的制备。
1.组织切片新鲜标本立即用4％中性甲醛（10％中性福尔马林）固定18～24小时，常规脱水、透明、浸蜡、制成蜡块。4μm 切片。必要时玻片进行防脱片处理。62℃烤片过夜、常规脱蜡、水化后备用。
2.冷冻切片新鲜组织用OCT 包埋，迅速置－23℃左右的恒冷切片机里冷冻，OCT 发白变硬后切片，4℃冷丙酮固定10分钟备用。
3.细胞涂片、细胞爬片各种细胞涂片、印片按常规方法制备。待稍干燥后浸泡于4℃冷丙酮固定10分钟。细胞爬片用中性缓冲液或生理盐水洗去培养液后用4℃冷丙酮固定10分钟。
4.固定液
4％中性甲醛（10％中性福尔马林）固定液：甲醛（40％）100ml磷酸二氢钠（NaH2PO4）4.0g无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）6.5g蒸馏水900ml（1）清洗：新载玻片经酸液浸泡过夜后流水冲洗，蒸馏水反复冲洗，95％乙醇浸泡2小时，擦干或烘干。
（2）涂胶：①白胶，又称木工胶，使用浓度为1％～2％，直接涂片、晾干。
②多聚赖氨酸（poly－l－lycine，PLL）液
PLL0.5g蒸馏水100ml 4℃或低温保存备用，使用时按1∶10稀释涂片。方法为将清洗后玻片浸泡于稀释液中数十秒，沥干，45℃烤箱内烘干，可长期保存。
③APES：将APES用丙酮按1∶50稀释，将清洗后的玻片浸泡于稀释的APES液30秒，再于丙酮中刷洗2次，烘干备用。
（三）被检组织抗原的修复
经4％中性甲醛一类的含醛固定剂固定后的组织，其组织中抗原因蛋白内蛋白间的亚甲基形成桥连，使抗原决定簇被封闭，从而影响抗原抗体反应。对于大多数抗体，在进行免疫组化染色前进行抗原修复处理，将固定时形成的蛋白交联破坏，恢复其原有的空间形态，使节抗原决定簇充分暴露，并使组织的通透性提高以利于抗原抗体的结合，增强检测的阳性率和反应强度。然而，仍有部分抗体不需要进行抗原修复（修复无利甚至有害），需修复的抗体还需选择不同的修复方法或联合修复方法。所以应按试剂说明书中的要求选择是否抗原修复或选择何种方法的抗原修复。抗原修复主要为酶消化法和热修复法。
1.酶消化法
（1）胰蛋白酶消化法：
①组织切片脱蜡、水化。
②0.1％胰蛋白酶液37℃孵育20～40分钟（孵育时间长短取决于固定时间的长短和被检测抗原的不同，但时间不宜太长）。
③蒸馏水冲洗数次。
④进行下一步免疫组织化学染色。
（2）胃蛋白酶消化法：此法一般用于细胞间质抗原的显示。
①组织切片脱蜡、水化。
②0.4％胃蛋白酶液，37℃孵育10～30分钟（孵育时间不宜过长）。
③蒸馏水冲洗数次。进行下一步免疫组织化学染色。
2.热修复法
（1）微波处理法：组织切片脱蜡、水化。将切片放入微波炉（75W）里盛有已煮沸缓冲液（200ml抗原修复液）的耐热容器中，继续加热至沸腾95～98℃，5分钟，3次，每次之间加蒸馏水恢复缓冲至200ml处。避免切片干燥。取出容器，置室温冷却20分钟（切片可从缓冲液中取出冷却）。蒸馏水冲洗数次。进行下一步免疫组化染色。
（2）高压锅法：组织切片脱蜡、水化。选4～6L 的不锈钢高压锅。加入抗原修复液，其量约为高压锅容积的2／3。不加阀情况下加热至沸腾。将切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，并置于高压锅内沸腾的缓冲液中，加阀后加热至喷气后计时1～2分钟。停止加热。高压锅自行冷却或流水冷却减压至室温（一定要冷却后才可开盖）。
去阀开盖，取出切片，蒸馏水冲洗数次，缓冲液TBS／PBS冲洗数次。进行免疫组织化学染色。
（3）电饭煲法：组织切片脱蜡、水化。将电饭煲加水适量（不会烧干）。将放抗原修复液的容器置于上层屉中，加盖加热至水沸腾。将切片置修复液中，继续加热沸腾20分钟（隔水蒸气加热）。停止加热保温10分钟后取出容器，冷却至室温后切片蒸馏水冲洗数次。进行下一步免疫组织化学染色。
3.抗原修复液及消化液
0.01mol／L 柠檬酸缓冲液pH6.0，0.1mol／L Tris-HClpH 8.0，1mol／LEDTA-NaOH pH8.0。
0.1％胰蛋白酶：100mg胰酶＋0.1CaCl2100ml，用0.1mol／L NaOH 调pH 至7.8。
0.4％胃蛋白酶：0.4g ＋0.1mol／LHCl100ml。
（四）组织切片中内源性酶的阻断
影响免疫组织化学结果的内源性酶主要有过氧化物酶、碱性磷酸酶和生物素。它们主要存在于血细胞中以及肝、肾、胰等的细胞中，而大部分组织均不含内源性酶。通过阻断后常导致被检测抗原变性，影响特异性着色反应。因此，阻断内源性酶一般不必作为常规步骤。为减少对检测抗原的影响，常将此步骤放在加完第一抗体后进行。
1内源性过氧化物酶0.3％～3％H2O2－甲醇溶液室温处理20分钟。
2内源性碱性磷酸酶24mg／ml左旋咪唑＋底物液pH8.0处理20分钟。
3内源性生物素0.5mg／ml～25μg／ml卵白素或10％蛋清溶液中处理30分钟。
（五）正常血清封闭
非特异性背景染色主要是被检组织常有正电荷。如纤维组织、变性坏死组织等与带有负电荷的抗体发生静电吸附作用，封闭这种非特异性染色是在加第一抗体之前，用非免疫的第二抗体动物血清，浓度为1∶5～1∶20。也可用2％～5％牛血清白蛋白，时间为10～20分钟，有明显溶血的血清不能用。
（六）抗体的选择、稀释和保存
1选择抗体应先了解其反应谱和适应条件。如是否用于石蜡切片、其稀释度和孵育时间及温度等。并且了解着色反应的部位，必要时参考说明书。选择不同稀释度阳性片进行预试验，根据染色阳性表达程度和背景着色程度确定最佳染色稀释度。
2原液装的抗体应于分装后置于－20℃冷冻保存。切勿反复冻存，以免降低效价。抗体工作液置4℃冰箱保存。
3.抗体的稀释
（1）选购商品化的抗体稀释液。
（2）0.01M PBSpH7.4或0.05M TBSpH7.6。
（3）必要时加适量小牛血清蛋白。
（4）缓冲液
①0.01M PBSpH7.4
NaH2PO4.2H2O3.0gNaCl85g
NaH2PO4.2H2O29g
蒸馏水1000ml 用时10倍稀释成0.01M。
②0.05M TBS pH7.6
A 液：30gTris ＋17mlHCl加水至500ml。
B 液：NaCl45g加水至500ml。
用时，A 液100ml＋B 液100ml加蒸馏水至1000ml。三、免疫组织化学染色常用方法免疫组织化学染色方法有直接法、间接法、PAP 法及双PAP 法、SPA 法、ABC 法、SABC 法、LSAB（SP）法、CSA、Envision 二步法和双重免疫组织化学法。但常用的方法为ABC 法、SP 法则、和Envision二步法。
（一）ABC 法或SP 法
ABC 法是卵白素－生物素－酶复合物（Avidin－Biotin－peroxidasecomplex）法的简称，SP 法则是Streptavidin－Biotin 的简称。它们具有很大的放大作用。
1切片脱蜡至水。
20.3％～3％H2O2－甲醇阻断内源性过氧化物酶。
3TBS或PBS。
4抗原修复。
5正常血清封闭。
6甩去正常动物血清后直接加第一抗体，湿盒孵育30～60分钟或4℃冰箱过夜。
7缓冲液洗数次。
8生物素化的第二抗体30分钟。
9缓冲液洗数次。
10ABC 复合物或SP 复合物（ABC 复合物即用即配），30～60分钟。
11缓冲液洗数次。
120.04％～0.05％DAB－H2O2显色液显色5～10分钟，镜下观察控制时间。
配制：DAB：40～50mg；0.05mol／L TBS（pH7.6）100ml；3％H2O20.1ml。
13缓冲液洗、流水洗。
14苏木素复染细胞核。
15脱水、透明、封片。
（二）Envision二步法
Envision是葡萄糖多聚体复合物，具有很强大的放大作用。
1～5步同ABC 法。
6.第一抗体30～60分钟或4℃冰箱过夜。
7.缓冲液洗数次。8.EnvisionTM 10～30分钟。9步骤同ABC 法第11～15步。
四、免疫组织化学染色的常用抗体标记物
1上皮CK EMA CEA PSA。
2间叶VIM。
3肌源Desmin Myosin MyoglobinActin。
4血管CD31CD34F8。
5组织细胞CD68Mac387。
6淋巴造血LCA CD20CD45RO CD3CD79。
7神经源NSE GFAPS100。
8神经内分泌SynCgA。
9细胞增殖PCNA Ki－67。
10黑色素HMB45。
11癌基因／抑癌基因P53CerbB－2C－myc。
12病毒体EBV HPV。
图像分析及病理照相技术
一、图像分析技术
（一）概述
图像分析技术是应用体视学理论，用手工或计算机对图像进行定量的描述。手工方法是应用网格系统或短线阵系统进行测量，计算机图像分析大大简化了分析过程，提高了效率，扩大了图像分析的应用范围。
（二）图像分析技术内容
图像分析技术的运用范围非常广泛，在生物医学领域，主要可归纳为以下5个方面：①二维形态参数的测量，包括线段长度、面积、直径、周径等；②通过二维参数推导三维结构参数的测量，如体密度、面密度、圆球度、异形指数等；③灰度及光密度的测量，包括DNA 测量、组织化学、免疫组织化学、原位杂交等特殊染色阳性程度的测量；④色度分析，包括荧光染色、组织化学、免疫组织化学、原位交杂等分析；⑤三维重建，包括组织切片、CT 扫描片、激光共聚焦扫描显微镜。另外，也可以根据实际需要，把上述各种测量结合起来应用。
（三）图像分析在病理学中的应用
1.在病理诊断中的应用通过选择适当的结构参数，细胞形态参数的测量，可以判断某种结构或细胞的特征，辅助诊断；通过对细胞DNA 倍体及细胞周期的分析，可以判断细胞的生长状态及周期分布情况；对某一种特定疾病或肿瘤，选择适当的参数对照专家诊断标准，建立计算机专家诊断系统进行计算机诊断。
2.在疾病治疗中的应用对肿瘤细胞周期及增殖指数进行分析，可以了解细胞生长状态以及细胞周期的百分比，有利于临床设计化疗方案，有效地减少化疗毒性，提高疗效。
3.在肿瘤预后判断中的应用建立肿瘤不同参数与肿瘤预后的关系，进行肿瘤预后判断。 4.在病因学中的应用通过形态测量，定量地分析病变中的某种成分或基质与病理改变的关系，判断其在疾病发生、发展过程中的作用，为病因学分析提供依据。
