特殊染色
一、结缔组织复合染色法
（一）Mallory三色染色法
试剂配制：
重铬酸钾液：重铬酸钾2.5g，醋酸5ml，蒸馏水95ml。
苯胺蓝橘黄G 液：苯胺蓝0.5g，橘黄G2g，磷钨酸1g，蒸馏水100ml。
酸性复红液：酸性复红0.5g，蒸馏水100ml。
染色步骤：
中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水；重铬酸钾液10分钟；流水冲洗2分钟，蒸馏水2次；酸性复红液2分钟，蒸馏水稍洗；苯胺蓝液20分钟，95％乙醇快速分化；直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：
胶原和网状纤维呈蓝色，软骨、粘液、淀粉样变物质呈淡蓝色，神经胶质纤维、肌纤维和酸性颗粒呈红色，髓鞘和红细胞呈橘红色。
注意事项：
酸性复红液易溶解于水，眼观察切片上保留一定的红色。苯胺蓝液染色后，用95％乙醇分化时，须镜下观察掌握。
对陈旧的固定标本，其染色效果较差，可增加染色时间。
另一张切片，可同时做胶原纤维对照染色而进行组织成分鉴别。
（二）Masson三色染色法
试剂配制：
Masson复合染色液：酸性复红1g，丽春红2g，橘黄G2g，0.25％醋酸300ml。
亮绿染色液：亮绿SFO1g，0.2％醋酸100ml。
染色步骤：
中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水；Masson 复合染色液5分钟；0.2％醋酸水溶液稍洗；5％磷钨酸5～10分钟；0.2％醋酸水溶液浸洗2次；亮绿染色液5分钟，0.2％醋酸水洗2次；无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：胶原纤维呈绿色，肌纤维呈红色，红细胞呈橘红色。
注意事项：
Masson复合染色液，经磷钨酸分化时须用显微镜控制肌纤维至清晰为止。
亮绿染料可用苯胺蓝替换，可用来对比观察染色的效果。
（三）显示胶原、网状和弹力纤维的三联染色法（1993年）试剂配制：
高锰酸钾硫酸液：0.5％高锰酸钾水溶液中加入5ml的硫酸。维多利亚蓝（Victoriablue）染色液：见弹性纤维染色法。
丽春红S（PonceauS）染色液：见胶原纤维染色法。
Gomori氨性银改良染色液：取5％硝酸银水溶液5ml，滴加浓氨水由棕黑变清为止，再加入3％氢氧化钠水溶液5ml，此时该液突变为紫黑色，这时再加入氨水使之变清晰为止。最后用蒸馏水补足至50ml，盛棕色试剂瓶中，置于冰箱中备用较长时间。
染色步骤：
（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（2）高锰酸钾硫酸液氧化3分钟，自来水浸洗后，用2％草酸漂白2分钟。
（3）5％硫酸铁铵1分钟。
（4）Gomori氨性银改良液染1分钟。
（5）蒸馏水洗2次，用15％甲醛液还原1分钟。
（6）蒸馏水洗2次，0.2％氯化金30秒，蒸馏水1次。
（7）70％乙醇浸1次，再浸入维多利亚蓝液中染30分钟至1小时。
（8）95％乙醇分化1分钟左右。
（9）浸入蒸馏水中1分钟后，用丽春红S染色液染色2分钟。
（10）直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：胶原纤维呈红色，网状纤维呈黑色，弹性纤维呈绿色，肌肉和红细胞呈淡黄色。
注意事项：
氨性银液滴染色时，要用干净吸管，防止银液污染而发生沉淀。氨性银液作用后的切片不能倾倒，应用蒸馏水冲洗切片上的银液，这样就不会使银液表面挥发的银颗粒沉积在组织上。
二、胶原纤维染色
（一）显示胶原纤维、细胞和肌肉的新染法（1992年）试剂配制：
（1）Poceau染色液：5％Poceau（丽春红S，上海试剂三厂）水溶液10～15ml，苦味酸饱和水溶液85～90ml。
（2）VictoriablueB 染色液：VictoriablueB（维多利亚B，上海试剂三厂）0.5g，70％乙醇100ml。
染色步骤：
（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（2）70％乙醇稍洗后，浸入VictoriablueB 染色液中15分钟。
（3）95％乙醇中分化数秒钟。
（4）用蒸馏水洗2次。
（5）用Ponceau染色液滴染5分钟。
（6）直接用无水乙醇分化与脱水。
（7）二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：胶原纤维呈红色，细胞核和血细胞呈绿色，肌肉呈黄色。
注意事项：
（1）胶原纤维切片的厚度需6μm，使之对比清晰。
（2）Victoriablue染色液应盛染色缸内，进行染色。
（3）Ponceau 染色后，不能与水接触，直接用无水乙醇冲洗脱水。
（二）Siriusred苦味酸染色法
试剂配制：
（1）天狼星红饱和苦味酸液：0.5％天狼星红（siriusred）10ml，苦味酸饱和液90ml。
（2）天青石蓝液：天青石蓝B1.25g，铁明矾1.25g，蒸馏水250ml。溶解煮沸，待冷却过滤后，加入甘油30ml，然后再加入浓盐酸0.5ml。
染色步骤：
（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（2）入天青石蓝液染5～10分钟。
（3）蒸馏水洗3次。
（4）天狼星红饱和苦味酸液染15～30分钟。
（5）无水乙醇直接分化与脱水。
（6）二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：胶原纤维呈红色，细胞核呈绿色，其他呈黄色。
注意事项：
（1）细胞核复染色可以用Harris苏木素染色液淡染。
（2）染色封固后的切片，须及时用偏光显微镜进行观察和照相，以保持鲜艳的色彩。
（注：在偏光显微镜下可以观察到4种类型的胶原纤维。
①Ⅰ型胶原纤维：紧密排列，显示很强的双折光性，呈黄色或红色的纤维。
②Ⅱ型胶原纤维：显示弱的双折光，呈多种色彩的疏松网状分布。
③Ⅲ型胶原纤维：显示弱的双折光，呈绿色的细纤维。
④Ⅳ型胶原纤维：显示弱的双折光的基膜，呈淡黄色）三、网状纤维染色（一）Gomori银染色法试剂配制：
氨性银溶液：甲液，硝酸银10.2g，蒸馏水100ml。乙液，氢氧化钠3.1g，蒸馏水100ml。取甲液5ml，滴加氨水至溶解清亮为止。再加入5ml乙液，此时该液突变为黑色，再滴加氨水至清亮为止。补加4滴氨水，用蒸馏水补足50ml。
染色步骤：
（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片5μm，常规脱蜡至水。
（2）高锰酸钾氧化液：高锰酸钾0.5g，蒸馏水95ml，再加入5ml3％硫酸5分钟。再用自来水洗1分钟。
（3）2％草酸漂白2分钟，水洗2分钟。
（4）2％硫酸铁铵媒染2分钟。
（5）水洗1分钟，蒸馏水洗2次。
（6）入氨性银溶液内1分钟。
（7）蒸馏水洗2次后，用20％甲醛液还原5分钟。
（8）蒸馏水浸洗2次。
（9）0.2％氯化金液1分钟，蒸馏水洗2次。
（10）用丽春红S苦味酸染色液复染3～5分钟。
（11）直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：网状纤维呈黑色，胶原纤维呈红色，背景呈黄色。
注意事项：
（1）配制氨性银溶液时必须将器皿洗干净。滴加氨水时不能过量。此液应放在冷箱内保存备用。
（2）氧化液存放时间不能过长，以免失去氧化作用。
（3）丽春红复染液一般须滴染方便，无水乙醇冲洗时要将切片倾斜，防止染液停留在切片上，以免使组织中的胶原纤维分布不均。
（二）James染色法
试剂配制：二氨银液：把氨水一滴一滴加入20ml10％的硝酸银液中，边加边摇动容器，直至滴加到最初形成的沉淀恰好溶解。注意，当这种沉淀物接近于完全溶解时，在每加一滴浓氨水期间，允许耽搁几秒钟，并轻摇容器，以免浓氨水加得太多。最好使沉淀物不要全部溶解。最后再加入一滴10％硝酸银和20ml蒸馏水。
染色步骤：
（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片5μm，常规脱蜡至水。
（2）酸化高锰酸钾氧化液5分钟，蒸馏水洗2次。
（3）入5％草酸水溶液中5分钟，蒸馏水洗3次。
（4）入5％硝酸银中5分钟，蒸馏水洗3次。
（5）二氨银液作用2分钟，蒸馏水洗3次。
（6）5％甲醛液还原5分钟。
（7）蒸馏水浸洗3次。
（8）用丽春红苦味酸滴染3～5分钟。
（9）直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：网状纤维呈黑色，胶原纤维呈红色，背景呈淡黄色。
注意事项：
（1）5％硝酸银液要放入冷箱内保存备用。在使用时不能滴染，应放在立式5片染色缸内进行，防止银污染组织。银液染色后用蒸馏水浸洗较好。
（2）二氨银呈带正电荷的离子状态，能够被具有嗜银性质的网状纤维所吸收，经过甲醛还原成金属银，所以说甲醛液要新配制，不能用陈旧性的溶液，防止影响银化合物还原成金属银。
四、显示弹性、胶原纤维的双重组合染色法（1993年）试剂配制：
（1）维多利亚蓝染色液：维多利亚蓝（Victoriablue）2g，糊精0.5g，间苯二酚4g，蒸馏水200ml。将上述物质混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约5分钟。然后用另一容器取30％三氯化铁水溶液25ml，另行加热煮沸后慢慢倒入上述混合液中，继续煮沸3分钟，不断搅拌溶液使呈胶体状。去火冷却过滤，将滤纸上的残渣连同滤纸放在60℃恒温箱中烤干。残渣呈深蓝色细颗粒状粉末，再溶于400ml70％的乙醇液，然后加浓盐酸4ml和苯酚5g，放置至成熟后使用。
（2）丽春红S 染色液：0.5％丽春红（Ponceau，-上海试剂三厂出品）15ml，加苦味酸饱和水溶液（1.22％）85ml。
染色步骤：
（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（2）切片入70％乙醇中洗2分钟。
（3）将切片浸入盛有维多利亚蓝液中染0.5～2小时。
（4）直接入95％乙醇中分色数秒钟。
（5）浸入蒸馏水洗2分钟。
（6）用丽春红S液滴染切片5分钟。
（7）直接用无水乙醇冲洗多余染色液2次。
（8）将切片在空气中或冷风中干燥。
（9）二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：弹性纤维呈蓝绿色，胶原纤维呈红色，背景呈淡黄色。
注意事项：
（1）维多利亚蓝液可多次反复使用效果不减，溶液在室温中保存可用数年，染色时还可以缩短时间。
（2）维多利亚蓝液在乙醇中分色后，要立即浸入水中，此后在镜下观察纤维的深浅度，如果较深可以再分色。
（3）丽春红液染色后要用无水乙醇从切片一端快速冲洗，并将切片斜放，稍干燥即透明封固，防止过于干燥使切片产生黑色颗粒。
五、横纹肌组织染色
试剂配制：Mallory磷钨酸苏木素染色法（PTAH）（1）Mallory磷钨酸苏木素液（PTAH）：苏木素0.1g，磷钨酸2g，蒸馏水100ml。
将苏木素置20ml蒸馏水中加热溶解，再将磷钨酸溶于80ml 蒸馏水中。苏木素冷却后加入磷钨酸溶液，混合后置放，经阳光处理数周至数月才成熟。
（2）高锰酸钾氧化液：0.5％高锰酸钾溶液50ml，0.5％硫酸溶液50ml。
染色步骤：
（1）Zenker固定组织或中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（2）在高锰酸钾液中氧化5～10分钟。
（3）自来水洗2次后，用1％草酸漂白2分钟。
（4）自来水洗，蒸馏水洗2次。
（5）浸入MalloryPTAH 液中12～48小时。
（6）直接用95％乙醇分化。
（7）无水乙醇脱水，二甲苯透明和中性树胶封固。
结果：胞核、纤维、肌肉、神经胶质纤维、纤维素、横纹肌等均呈蓝色；胶原纤维、网状纤维、软骨基质及骨呈黄色或玫瑰红色；粗弹性纤维有时被染成微紫色；有缺血缺氧等早期病变的心肌呈紫蓝色或棕黄色。
注意事项：
（1）此液在室温下自然成熟后，置冰箱内保存可使用多年时间，其效果不减。
（2）如果实验时急需用试剂，可在PTAH 染色液中加入0.15g 的高锰酸钾，以加速促使成熟。
（3）95％乙醇分化时应注意在切片上保留一定的红色，然后用无水乙醇快速脱水，冷风稍干燥后封固。
六、糖类染色
过碘酸－Schiff液（PAS）染色法
试剂配制：
（1）高碘酸氧化液：高碘酸0.5g，蒸馏水100ml。此液溶解后应保存于冰箱中待用。
（2）Schiff液：碱性复红1g，1mol／L 盐酸20ml，重亚硫酸钠2g，重蒸馏水200ml。先将200ml重蒸馏水煮沸，稍有火焰，加入1g 碱性复红，再煮沸1分钟。冷却到50℃加入1mol／L 盐酸20ml，待35℃时加入2g重亚硫酸钠。室温中2小时之后见稍带红色，5小时之后变为无色液体。棕色瓶内装好，封口，放入冰箱中保存待用。
染色步骤：
（1）用Carony固定液或无水乙醇液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（2）蒸馏水洗。
（3）高碘酸氧化液10～20分钟。
（4）蒸馏水洗2次。
（5）Schiff液染色10分钟。
（6）流水冲洗5分钟（对着色较深颜色的切片可缩短时间）。
（7）用Mayer或Harris明矾苏木素液染核2～3分钟。
（8）0.5％盐酸乙醇分化，自来水洗后将细胞核变蓝为止。
（9）无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
