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第11章 基因工程(2)

水稻种子中的蛋白质含量约为5%~8%,在禾本科作物中为最少,而且氨基酸的组成也很不均一,大部分的水稻赖氨酸和色氨酸含量低,而谷氨酸却过剩。含量低的氨基酸无法满足人类的营养要求,而过多的谷氨酸却影响着水稻的酿酒特性。如何提高水稻中的蛋白含量总量和合理调整水稻的氨基酸成分是我们面临的科研难题。现在,科学家将编码tRNAly8(赖氨酸摆动密码子)的DNAs转入水稻愈伤组织。DNAs能引起赖氨酸插入到种子中谷氨酸和天冬氨酸特别丰富的氨基酸序列中,也能使赖氨酸和终止密码子连在一起,让蛋白质合成结束或高频率地中断种子的蛋白质合成。转基因再生植株的检测发现蛋白质的组成类型没有明显变化。在一部分植株中2%~3%的谷蛋白发生变化,同时发现醇溶蛋白中赖氨酸提高了40%~75%。这些转基因水稻的赖氨酸含量平均提高了6%。

除了蛋白质,水稻的淀粉组成也是决定水稻品质的因素,一般来说,水稻的直链淀粉含量过高是造成杂交水稻食用品质差的主要原因之一。不同水稻品种的直链淀粉含量的差异较大,一般籼稻品种的直链淀粉含量较粳稻高,多在20%~30%,粳稻在15%~22%。陈秀花、刘巧泉等通过农杆菌介导,将反义Wx基因导入我国籼型杂交稻的保持系龙特甫B等3个高直链淀粉含量的重点亲本中,结果表明,多数转基因水稻的直链淀粉含量出现不同程度的降低,最低的下降至7%左右。

2. 基因工程和培育抗虫作物

提高基因工程和抗虫作物,人们最常想到的是大面积的成功推广的抗虫棉。抗虫棉是我们推广最多,应用最多的转基因抗虫作物。转Bt基因抗虫棉,是利用现代生物技术将苏云金杆菌(简称Bt)的杀虫蛋白基因导入棉花植株体内而培育出来的棉花新品种。由于转Bt基因抗虫棉自身能产生杀虫蛋白,对棉花的主要害虫棉铃虫等鳞翅目害虫有较好的抗性,减少了化学农药的用量和使用次数,降低了植棉成本,减少了农药对农田生态系统的破坏,受到了普遍欢迎。

棉铃虫对棉花的危害很大,棉铃虫危害造成棉花普遍减产,像1992~1993年我国棉铃虫大爆发造成的产量损失巨大,当年全国损失就达几十亿元,棉农“谈虫色变”。为了控制棉铃虫的危害,全球普遍采用化学防治。我国化学杀虫剂约占农药总量的70%以上,年产量22万吨左右,其中30%以上用于防治棉铃虫。大剂量、长时间的农药防治不仅使棉铃虫产生了抗药性,而且对生态环境产生了极大的危害,棉农和牲畜中毒事件也有发生,棉农种棉的积极性降低,植棉面积下降。

为解决棉花生产上的棉铃虫问题,在国家有关部门的支持下,我国自1991年开始了转苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因(Bt基因)单价抗虫棉的研究,由中国农科院生物技术研究所郭三堆研究员主持,设计并合成了能在植物中表达的杀虫基因,构建了高效表达目的的基因表达载体,通过花粉管通法导入棉花,研制成功了单价抗虫棉。这种棉花细胞内含有的杀虫基因可合成一种杀虫蛋白,专门破坏鳞翅目害虫的消化系统,导致昆虫死亡。经专家鉴定,这项研究成果达到了国际先进水平,使我国成为继美国之后,第二个研制成功抗虫棉的国家。

1993年,我国科学家又预见性地开展双价抗虫棉的创新研究。研制成功了可同时在棉花中产生两种不同机理杀虫蛋白的双价抗虫棉。实验表明,比单价抗虫棉不但可以有效延缓棉铃虫对抗虫棉产生抗性,而且可增强抗虫棉的抗虫性。双价抗虫棉已经进入生产应用,在国际上居领先水平。

转基因抗虫棉商品化生产始于1996年,1997年全世界种植还不到1500万亩,2000年已发展到6000-7500万亩。全世界棉花面积的20%为转基因棉花。美国2001年转基因抗虫棉面积就达到棉田的74%。 我国1996年开始试点种植转基因抗虫棉,1997年种植面积4.5万亩,1999年种植达825万亩,2006年的种植面积已超过6000万亩。抗虫棉的推广应用,有效地控制了棉铃虫的暴发为害,在减少治虫的情况下不影响产量,同时可节约农药60%-80%。对降低棉花生产成本、增加农民收入、减轻环境污染,实现我国棉花生产的可持续发展具有重要意义。

除了抗虫棉,抗虫转基因玉米、马铃薯也已经商业化,而抗虫水稻、高粱、番茄等的抗虫研究进展也十分顺利,有望在不久的将来大面积的应用推广,为农业的发展和我国的新农村建设做贡献。

3. 基因工程和培育抗病作物

植物的病害分为真菌病,细菌病和病毒病三类,章 DNA 直接导入受体植物,从后代中筛选具有抗病能力的个体,经过稳定得到转基因抗病植株。因此,要想获得一个转基因的植物,首先要筛选到一个良好的抗病基因。

狭义上的抗病基因是指寄主体内能特异性识别病原并激发抗病反应的基因,它与病原菌的无毒基因 Av抗病基因 (avirulence gene) 互补。编码胞外和胞内两种类型的受体蛋白,是抗病反应信号转导链的起始组份,当与病原菌的无毒基因直接或间接编码产物(配体)互补结合后,启动并传导信号,激发如过敏反应 H抗病基因 (hypersensitive response) 和系统获得抗性 SA抗病基因 (System acquired resistance) 的抗病反应。由于抗病基因是一类诱导表达的不知产物和性质的基因,传统的基因分离方法不再适合。因此分离抗病基因一直是个难题。第一个植物抗病基因Hml 是1992年 Johal 等用转座子标签法 (transposon tagging) 克隆到的。近年来随着图位克隆等方法在抗病基因分离上的成功应用,已先后分离出近20个抗病基因。

目前无毒基因在植物抗病基因工程上的实际应用很广,且有良好的应用前景,因此克隆无毒基因具有重要的意义。克隆无毒基因主要有三种方法:(1)基因库互补法。通过细菌交配实验,将一个病原菌小种基因克隆互补到另一个小种菌株中,从而使后者的寄主特异性发生改变而进行克隆;(2)产物导向法。根据无毒基因编码的产物性质,先分离无毒基因的转录产物合成寡核苷酸探针,然后从病原菌基因组文库或 cDNA 文库中筛选无毒基因克隆。Avr4 和 Avr9 便是用此方法克隆到的;(3)转座子标签法。与 R 基因转座子标签法克隆方法类似,只是所用的是原核生物转座子如Tn5.

植物的防卫机制极其复杂,包括水解酶和病程相关蛋白 (PR蛋白) 的产生、植物保卫素的合成和积累、细胞壁的木质化作用以及富含轻脯氨酸糖蛋白在细胞壁的积累等许多方面。

几丁质酶和葡聚糖酶在正常情况下只在植物体内有低水平的组成型表达。但病原菌侵染、诱导物处理及各种伤害可诱导产生高水平的几丁质酶和葡聚糖酶。章 Schlumbaum 等首次报道提纯的菜豆几丁质酶具有抗真菌活性以来,已经相继从菜豆、水稻、烟草、油菜、马铃薯、小麦、玉米和甜菜等多种植物中克隆到了几丁质酶基因,对立枯丝菌等20多种真菌表现出体外抑菌活性。一些葡聚糖酶基因也从大豆、大麦、烟草等作物中分离,与合适的启动子构建重组质粒后转化植物获得了转基因植物。

溶菌酶具有几丁质酶和葡聚糖酶的双重活性,对植物病原菌表现出很强的裂解活性。在已获得的 T4 噬菌体溶菌酶基因的转基因马铃薯中,虽然只有低水平的合成表达,但能有效地分泌到胞间隙中,明显提高对马铃薯黑胫病的抗性。

抗菌蛋白基因具杀死病原细菌的活性。从某些植物、昆虫、微生物中均分离到抗菌蛋白,也有报道成功地克隆了美洲商陆的抗菌蛋白基因,但还没有获得转抗菌蛋白基因的转基因抗病植株。不过,用人工合成的裂解肤基因转化烟草,获得的转基因烟草对青枯病菌感染表现出抗性。

在病原菌侵染致病过程中,病原菌产生的细胞壁降解酶和致病毒素起重要作用。例如,多聚半乳糖酸酶 (polygalacturonase PG) 是一种细胞壁降解酶,在一些双子叶植物中发现有多聚半乳糖酸酶抑制蛋白 (PGIPS),PGIPS 能有效地抑制植物病原菌的 PG 活性,提高植物的抗病能力。菜豆和梨的 PGIPs 基因已被分离克隆,正在进行转基因研究。

致病毒素是重要的致病因子,如果植物能降解病原菌在侵染过程中产生的毒素,那么植物就可以有效地对抗病原菌的进一步侵染,从而提高抗病的能力。病原菌具有自我保护作用的毒素降解酶系,从病原菌中分离克隆毒素降解基因并导入植物,就能提高植物的抗病性。

尖抱镰刀菌使许多植物患枯萎病,该菌产生的镰刀菌酸毒素在致病过程中起重要作用,已从 leebiella oxytoca HY-1 菌株中分离到了能降解镰刀菌酸的基因,并得到转基因番茄,其对 F。oxysporum 的抗性研究在进行中。而 Moffat 报道已经克隆了编码降解镰刀菌酸的基因,转基因植株对玉米枯萎病表现出抗性。

4. 基因工程和培育抗盐碱的作物

2003年12月9日,以中科院院士、欧亚科学院院士张新时为主任委员的中天杨鉴定委员会专家组通过了一抗盐碱新品种的鉴定,世界上第一个可用于大田生产的转基因抗盐碱杨树――中天杨(八里庄杨)由此诞生。专家组认定,这一研究成果在杨树抗盐性转基因体系及抗盐性新品种选育等方面达到国际先进水平。

专家鉴定转基因抗盐碱杨树中天杨新品种达到国际先进水平的根据是,国外从未见有关杨树基因抗盐研究的文献报道,国内也是第一个用转基因现代生物技术获得抗盐碱杨树的新品种。通过对这一转基因株系进行组培、盆栽、水培、田间试验等抗盐性测定,结果表明:当含盐量0.4%―0.5%时,组培、盆栽、水培等不同条件下,转基因株系的平均成活率分别达到70%、33%和65%,田间试验条件下转基因株系成活率达到54%―80%,而试验中所有对照杨树成活率极低甚至全部死亡。

这一成果具有重大的现实意义是,我国盐渍土面积达5亿多亩,相当于耕地的1/3.我国的森林资源总量严重不足,面临着社会巨大的生态需求和林产品供应短缺的压力。而我国耕地相当吃紧,恢复和建设生态所需的林业用地绝大部分要从包括盐渍土在内的荒地中去寻找。培育成功转基因抗盐杨树中天杨新品种,改变了过去单纯依赖传统育种和改良土壤提高植物抗逆的技术路线,从而走上了现代生物转基因技术育种,提高植物抗逆性的科学道路,这不仅是林木育种历史上的一次革命,也是盐碱地开发利用的一大进步,其经济、生态和社会效益是巨大的。

新品种中天杨是采用转基因技术研制成功。1996年,中国科学院、山东农业大学、山东金水木抗逆植物研究院联合成立课题组进行转基因抗盐杨树的科技攻关。课题组专家采用分子生物学、生物化学和细胞生物学等先进的技术手段,从抗盐碱、耐干旱、耐贫瘠的植物中提取1-磷酸甘露醇脱氢酶(mtl-D)基因,并选用在于旱瘠薄地能速生的优良品种八里庄杨叶片为材料,通过农杆菌介导法将1-磷酸甘露醇脱氢酶(mtl-D)基因转入受体植株。经聚合酶链式反应(PCR)和RNA印记(Northern)分子检测证明,mtl-D基因已整合到转化植物的基因组中。由于八里庄杨植株细胞内具有抗盐碱的基因,因而表现出较强的抗盐性。

在此之前,2001年,日本农工大学副教授小关良宏在海滨植物红树中发现了一种耐盐碱基因,利用它培育出的转基因大肠杆菌和烟草都显示了强烈的抗盐碱性。

2007年, 以色列科学家发现,有一种真菌能大大提高农作物的耐盐碱性。死海的海水含盐量居世界第一,每升海水含盐340克,是普通海水盐度的10倍,大部分地球生物都无法在这样的环境中生存。不过,有一些丝状真菌就在这里生活得自由自在。这引起了以色列科学家的极大兴趣。经过研究他们从这些丝状真菌体内找到了一种特殊的抗盐碱基因。

5. 基因工程和培育抗旱作物

随着水资源的进一步紧缺,抗旱植物对农业生产的重要性日益显得重要。目前利用基因工程技术培育抗旱品种主要有两种策略:1)增加植物渗透性代谢产物的合成能力,使植物在水分胁迫下能合成更多的渗透调节物质如脯氨酸,甘露醇、甜菜碱、海藻糖等,以提高植物的渗透调节能力,从而增强植物的抗旱性;2)增强植物对活性氧自由基的清除能力,使植物在水分胁迫下过量表达一些酶(如SOD,POD,CAT等),以有效地排除有害的活性氧自由基,从而提高细胞耐脱水的能力。

通过转基因技术,我们可以干扰脯氨酸,甜菜碱等物质的代谢途径,使其对干旱的应答更加灵敏,强度更加强烈。当植物遇到干旱环境的时候,能够迅速而准确地反应从而保护植物免遭危害或减轻危害程度。同时,向植物中导入保护酶的相关基因的实验已经获得很大的进展。SOD可分为Cu/Zn―SOD、Mn―SOD和Fe―SOD 3种类型。CM―SOD主要在叶绿体和细胞质中,Mn―SOD主要存在于线粒体中,ICe―SOD则主要存在于叶绿体中 将烟草的Mn―SODcDNA导入苜蓿后,转基因苜蓿的抗旱性得到了提高.将Mn―SOD基因定位到烟草的叶绿体和线粒体上.发现也能表达其基因,进一步研究发现.在叶绿体中Mn―SOD的过量表达使烟草受干旱所引起的氧化伤害程度比对照明显减轻.但线粒体中增加的Mn―SOD活性对烟草耐氧化胁迫能力没多大影响。 另外.表达拟南芥Fe―SOD的转基因烟草、表达番茄Cu/Zn―SOD的转基因烟草、过量表达豌豆Cu/Zn―SOD的转基因烟草均能增强抵抗干旱引起的氧化胁迫能力。

新的抗旱基因也在近几年不断有发现,2009年,华中农业大学科研人员成功分离出一个对水稻抗旱改良有显著作用的基因OsSKIPa,此项成果已发表在国际权威学术杂志美国《国家科学院院刊》(PNAS)上。据华中农业大学生命科学技术学院熊立仲教授介绍,OsSKIPa基因是通过基因芯片技术和转基因技术筛选得到的众多候选基因中的一个。实验显示,在干旱条件下,对照组水稻幼苗的存活率为20%至50%,转入OsSKIPa基因的实验组幼苗的存活率为80%以上;在成熟期,实验组的产量和结实率比对照组提高了20%左右。

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