（1）测定方法概述：1983年用放射免疫法,1984年用酶联免疫吸附试验法,用失神经大鼠肌肉/电鳗电器官和人腓肠肌中提取的乙酰胆碱受体作抗原,竞争抑制法测定乙酰胆碱受体封闭抗体。先用125I标记烟碱样拮抗剂α-银环蛇毒素，而后用此结合物与可溶性人肌肉乙酰胆碱受体特异性结合，再用此结合物与病人血清免疫球蛋白发生沉淀反应。通过测定其放射活性来反映其乙酰胆碱受体抗体含量。结果发现：用人腓肠肌提取的乙酰胆碱受体作抗原的酶联免疫吸附试验方法进行检测，则重症肌无力病人血清中乙酰胆碱受体抗体的检出率为87％，若再加用乙酰胆碱受体封闭抗体，则其检出率可提高到95％。
（2）误差：血浆交换前，重症肌无力病人病情加重，测得血清中乙酰胆碱受体抗体高，血浆交换后，重症肌无力病人病情减轻，多数测得血清中乙酰胆碱受体抗体值也下降。但有少数重症肌无力病人，于血浆交换后随其重症肌无力病情好转时，却测得其血中乙酰胆碱受体抗体，不是降低而反是升高。我们对这部分病人注意观察，发现：血浆交换前取的是血清，而血浆交换后取的是血浆。我们把同一病人的血清标本，分成两份，一份按血清进行测定，一份在加入枸橼酸钠后，再作测定。结果：后一份标本的OD值，即乙酰胆碱受体抗体值高于前一份标本者。由此可见，这是一种误差，即有时为了方便起见，就取血浆交换术后的血浆标本，由于血浆标本中含有枸橼酸钠，而使其测得的乙酰胆碱受体抗体值人为升高。事实上，这是一种假象，而非真正升高。
80怎样用酶联免疫吸附法测乙酰胆碱受体抗体？
（1）酶联免疫吸附试验的简要原理
先用α-银环蛇毒素包被于塑料板上4℃冰箱过夜。加乙酰胆碱受体，由于乙酰胆碱受体与α-银环蛇毒素之间特异性、不可逆性结合而使乙酰胆碱受体也间接结合于塑料板上。加标准抗血清或待测血清，若有乙酰胆碱受体抗体，通过乙酰胆碱受体抗体与乙酰胆碱受体间特异性结合而固定于塑料板上。加酶标的二抗、显色。有颜色的地方就是有二抗的地方，可由颜色的深浅来反映标本中乙酰胆碱受体抗体的含量多少。
（2）酶联免疫吸附法测定乙酰胆碱受体抗体的程序
A包被：用α-银环蛇毒素（1mg/ml）10μl+包被液10ml，每孔100μl，24h4℃保存，PBS-T洗3次，每次3min。
B加入乙酰胆碱受体：每支乙酰胆碱受体干粉加蒸馏水04ml混匀。再1∶10稀释备用。10μl（1∶10R）+10mlPBS-T混匀，每孔100μl，37℃ 1h。PBS-T洗3次，每次3min。
C血清及乙酰胆碱受体抗体工作标准：病人血清或稀释的乙酰胆碱受体抗体工作标准液，每孔100μl，37℃ 30min。PBS-T洗3次，每次3min。
D结合物：辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG结合物，每支溶于05ml蒸馏水中。取其溶解物30μl结合物加15ml PBS-T混匀，每孔100μl，37℃ 30min。PBS-T洗3次。
E底物：邻苯二胺4mg+底物缓冲液10ml+3％过氧化氢15μl（用时现配）每孔100μl，暗处37℃ 5min。
F终止：2mol/L H2SO4，每孔50μl。
G测OD：490nm波长下检测OD值。
（3）乙酰胆碱受体抗体测定中ELISA试验缓冲液的配制
①包被液：pH96，Na2CO3 159g，NaHCO3 293g，蒸馏水加到1000ml，4℃保存。
②PHS-T：pH74，KH2PO4 02g，Na2HPO4·12H2O 29g，NaCl 80g，KCl 02g，Tween-20 05ml，蒸馏水加至1000ml，4℃保存。
③底物缓冲液
A液：01mol/L柠檬酸缓冲液。柠檬酸（分子量＝2014）2104g加蒸馏水至1000ml。
B液：02mol/L磷酸缓冲液。Na2HPO4·12H2O（分子量＝35814）716g加蒸馏水至1000ml。
取A液243ml，B液257ml，加蒸馏水至100ml（每10ml加H2O215μl加邻苯二胺现用现加）。
④2mol/L H2SO4。
81怎样用放射免疫法测乙酰胆碱受体抗体？
先用125I标记烟碱样拮抗剂α-银环蛇毒素，而后用此结合物与可溶性人肌肉乙酰胆碱受体特异性结合，再用此结合物与病人血清免疫球蛋白发生沉淀反应。通过测定其放射活性来反映其乙酰胆碱受体抗体含量。用免疫沉淀法测定乙酰胆碱受体抗体的基本原理是先由人截肢小腿腓肠肌提取乙酰胆碱受体，于-70～-80℃保存备用，其浓度为5～10nmol/L。把提取的乙酰胆碱受体与用125I标记的α-银环蛇毒素相互作用，结合成125I-α-银环蛇毒素-乙酰胆碱受体。再加入重症肌无力病人的血清（含乙酰胆碱受体抗体，即人IgG），形成125I-α-银环蛇毒素-乙酰胆碱受体-乙酰胆碱受体抗体-人IgG抗体复合物沉淀，最后测定此复合物的125I放射活性。待测标本中乙酰胆碱受体抗体含量（C）的计算方法及单位如下：C＝（待测标本测得cpm-正常混合血清cpm）×待测标本测得IgG值/正常混合血清cpm×正常混合血清IgG值（任意单位/升：arbitrary unit/L）。cpm为放射性核素测定单位，即每分钟内的计数。
82在乙酰胆碱受体抗体检测系统中怎样对乙酰胆碱受体进行选择？历史上在乙酰胆碱受体抗体检测系统中曾先后用过提取乙酰胆碱受体的组织来源依次为：电鳗电器官、大鼠正常和失神经的腓肠肌、人腓肠肌。用由人腓肠肌提取的乙酰胆碱受体辅以直接封闭抗体检测，则重症肌无力病人血清中乙酰胆碱受体抗体的检出率为95％，而用由大鼠腓肠肌提取的乙酰胆碱受体其相应抗体的检出率仅为50％。在此检测系统中乙酰胆碱受体抗体的检出率，以用由重症肌无力病人腓肠肌提取的乙酰胆碱受体为最佳，失神经的人腓肠肌其次，大鼠去神经的肌肉更次，电鳗电器官提取的乙酰胆碱受体检测效果最差。
83乙酰胆碱受体抗体绝对效价的不足有哪些？
(1)不同病人不可比：有些重症肌无力病人血清乙酰胆碱受体抗体效价很高，但在临床上其肌无力并不很重。也就是说，不同重症肌无力病人，不能通过其血清乙酰胆碱受体抗体效价高低的比较来预言其肌无力的严重程度。重症肌无力病人的临床严重程度与乙酰胆碱受体抗体绝对效价相关不密切。单纯眼型重症肌无力病人此抗体效价较低，甚至多为阴性。而病情较重和伴胸腺瘤重症肌无力病人的此抗体效价较高。
(2)同一病人随访乙酰胆碱受体抗体效价的波动值也难以预言：一般说同一病人随访结果，其乙酰胆碱受体抗体效价与其临床上肌无力严重程度波动一致，即：重者高、轻者低。但其波动绝对值的意义也难以确切评价。有些病人在几年期间，其乙酰胆碱受体抗体效价恒定，但其临床病情可有明显变化。另一些病人，经胸腺放射治疗或胸腺摘除术后，其抗体效价有持续的下降。
84为什么说乙酰胆碱受体抗体相对效价与临床相对记分相关密切？（1）乙酰胆碱受体抗体相对效价：我们认为乙酰胆碱受体抗体绝对效价的不足可能与我们所测得的为乙酰胆碱受体抗体的总效价，其中有一部分是与重症肌无力无关的乙酰胆碱受体抗体，即所谓“无关”抗体有关。若一个病人血清中“无关”抗体效价高，则其乙酰胆碱受体抗体效价虽高，但其肌无力严重程度可以不太重。若另一个重症肌无力病人不含“无关”抗体，即均为致病的乙酰胆碱受体抗体，则其乙酰胆碱受体抗体效价虽然不高，但其肌无力严重程度可以很重。为了尽可能消除“无关”抗体的干扰，我们提出乙酰胆碱受体抗体相对效价的概念。
（2）乙酰胆碱受体抗体相对效价与临床相对记分相关密切：乙酰胆碱受体抗体相对效价＝（治疗前乙酰胆碱受体抗体相对效价—治疗后乙酰胆碱受体抗体相对效价）/治疗前乙酰胆碱受体抗体相对效价。我们把重症肌无力病人随访作详细的临床绝对记分及乙酰胆碱受体抗体绝对效价，经运算得到其临床相对记分和乙酰胆碱受体抗体相对效价，作直线回归检验其相关性，结果发现两者密切相关。因为临床相对记分可反映重症肌无力病人肌无力严重程度，所以乙酰胆碱受体抗体相对效价与重症肌无力病人肌无力严重度密切相关。
85血清乙酰胆碱受体抗体阴性重症肌无力的研究有哪些？10％～15％全身型重症肌无力病人血清中用一般标准的放射免疫法测不出乙酰胆碱受体抗体。此种血清乙酰胆碱受体抗体阴性重症肌无力病人的临床特点与血清中乙酰胆碱受体抗体阳性者并无差别。但多数阴性者仅有眼部症状，病程短于20年。有胸腺瘤的少见。把血清阴性重症肌无力病人的免疫球蛋白注入小鼠致使神经—肌肉接头处传导障碍，并有乙酰胆碱受体大量丧失。血清乙酰胆碱受体抗体阴性重症肌无力病人的抗体与培养肌细胞表面相结合，其所针对的靶尚不清楚。正常情况下碳酰胆碱可致22Na+流入人类肌细胞系（TE671）。血清阴性重症肌无力病人血浆能抑制碳酰胆碱所致22Na+流入TE671，而正常对照血浆并不能起此种抑制作用，说明重症肌无力病人血清中有种能抑制碳酰胆碱所致22Na+流入但并不能抑制TE671的乙酰胆碱受体与α-银环蛇毒素结合。小麦凝集素的作用相似。刀豆蛋白A不同，它是抑制碳酰胆碱所致。22Na+流入，也抑制乙酰胆碱受体与α-银环蛇毒素结合。若先用糖预处理小麦凝集素，则可预防由它所致的抑制22Na+流入作用。结论：小麦凝集素在TE671细胞乙酰胆碱受体上的作用与血清阴性重症肌无力病人血浆中的因子相似，若先用某些复合醣预处理则可预防此种作用。神经—肌肉接头处有神经节苷脂，所以它可能是神经—肌肉接头处受累的靶。用ELISA方法测定其中GM1、GM2、GM3、AGM1、GD1a、GD1b和GT1b的IgM和IgG抗体。至少30％重症肌无力病人有抗一种神经节苷脂的抗体。发生率最高为“年轻起病”和眼型病人，而后是胸腺瘤和“老年起病”病人。在“年轻起病”，尤其是乙酰胆碱受体抗体效价高（>10nmol/L）病人有抗所有神经节苷脂的多克隆抗体IgM和IgG应答。故某些重症肌无力病人，尤其是单纯眼肌型者，抗神经节苷脂抗体可能是致病的。
86重症肌无力自身免疫抗体谱有哪些？
当怀疑病人患重症肌无力或Lambert-Eaton肌无力样综合征时，应作有关自身免疫的血清学抗体谱检查。新近发生、轻度、眼型重症肌无力在用免疫治疗前不是单作某一试验，而是需要作一组抗体谱检测。乙酰胆碱受体结合抗体试验阳性对重症肌无力来说是特征性，而非诊断性的。乙酰胆碱受体结合抗体或横纹肌自身抗体可见于13％Lambert-Eaton肌无力样综合征病人。血清P/Q-型钙离子通道结合抗体阳性有助于重症肌无力（≤5％）和Lambert-Eaton肌无力样综合征（95％）的鉴别。一般不建议把乙酰胆碱受体封闭抗体用作筛选试验，但若乙酰胆碱受体调节抗体阳性，则乙酰胆碱受体封闭抗体阳性可用作其后临床病程和治疗定量检测的比较指标。血清抗随意肌抗体阳性高度提示有胸腺瘤。所有的血清学检测结果必须由临床医生结合病人的病史、查体、电生理所见、腾喜龙试验结果、胸部影像学所见和其他血清学所见（例如：抗骨骼肌、甲状腺和胃自身抗体，P/Q-型钙离子通道抗体）。
87重症肌无力其他生化、免疫学指标有哪些？
（1）肿瘤坏死因子
肿瘤坏死因子是激活的单核巨噬细胞分泌的一种可溶性细胞因子。它具有广泛的生物学活性，在维持机体免疫功能平衡、稳定中起重要作用。若它在体液中的含量过高，则可致机体免疫功能紊乱而与自身免疫性疾病的发病有关。用T5和E6单克隆抗体包被的双抗体夹心的ELISA法测定血清中肿瘤坏死因子含量，并同时用ELISA法测血清中乙酰胆碱受体抗体，结果发现：重症肌无力病人肿瘤坏死因子和乙酰胆碱受体抗体均明显高于健康对照组。全身型重症肌无力病人在强的松治疗后肿瘤坏死因子和乙酰胆碱受体抗体较治疗前明显下降。血清肿瘤坏死因子随访可有用作重症肌无力病人病情和疗效判定的参数。
（2）雌二醇
雌二醇通过淋巴细胞上雌二醇受体影响细胞的免疫功能。若给去势卵巢大鼠补充雌二醇，则会促使其胸腺萎缩，刀豆素A诱导胸腺细胞增生。血浆中雌二醇用双抗体免疫沉淀法测定，测定了滤泡刺激激素、黄体生成激素、睾丸酮、泌乳素等。结果重症肌无力组与对照组相比，除雌二醇重症肌无力组明显高于对照组外，其他均无明显差异。雌二醇可通过胸腺激素释放促进T细胞成熟，使CD8+细胞降低，CD4+/CD8+比值升高，抗体升高，而致自身免疫性疾病的病情加重。
88重症肌无力的临床诊断标准是什么？
1997年第五届全国神经免疫学术会议期间讨论了有关重症肌无力的诊断标准，现可把它简要归纳如下：
（1）临床：活动后加重、休息后减轻，晨轻暮重的随意肌无力。
（2）药理学：胆碱酯酶抑制剂试验阳性（有效）和对箭毒类药物的过度敏感。
（3）神经电生理：低频重复电刺激波幅递减，微小终板电位降低，单纤维肌电图上颤抖增宽。
（4）免疫学：血清乙酰胆碱受体抗体增多。
（5）免疫病理学：神经—肌肉接头处突触后膜皱褶减少，变平坦，其上有功能的乙酰胆碱受体减少。
对一般无神经电生理设备的非教学医院，只要凭前两条即可诊断。对有条件的教学医院等，作后三条则有助于其确诊和有利于研究。有波动性肌无力，甚至即使其体征是不可重复的病人也应考虑重症肌无力之可能。
89重症肌无力的临床症状特点是什么？
活动后加重，休息后减轻的随意肌无力。若令重症肌无力病人连续、重复做某一动作，由于其相应神经—肌肉接头处乙酰胆碱受体的储备已减少，此种受体休息机会相对减少，则因后来的刺激落入其相对或绝对不应期机会增多而表现为肌肉的易疲劳性和肌无力。于是临床上表现为：活动后加重、休息后减轻及晨轻暮重的随意肌无力症状。所以，病史中应注意详细询问是否有活动后加重、休息后减轻的随意肌无力症状。查体应注意随意肌的易疲劳性，例如：眼向上注视后久后就呈现上睑下垂，双臂平举稍久后就因疲劳而垂落，蹲立几次后就因疲劳而不能起立，甚至跌倒等。
