④血标本溶血不收（溶血性疾病例外，为了防止对溶血结果误判为阴性，建议反定型及交叉配血的细胞中加入EDTA溶液。由于EDTA能够螯合补体激活所需的Mg2+和Ca2+，故可阻断补体活化引起的红细胞破坏，即溶血）。
⑤用肝素治疗者的血标本未用鱼精蛋白对抗使之凝结不收。
⑥非医护人员送标本不收（护工送标本需要经过培训并授权，禁止闲杂人员送标本）。
⑦用右旋糖酐等大分子物质治疗后采集的血标本未作标记说明不收（如已标记说明应将细胞洗涤）。
（二）红细胞悬液的配制操作规程
1．原理：用一定量的稀释液（常用生理盐水）来稀释压积红细胞，达到一定的浓度。
因为在抗原与抗体特异性结合中须遵循一定的量比关系，只有二者比例适当才会出现最佳反应结果。
2．标本：抗凝全血2ml。
3．试剂：生理盐水。
4．仪器：Baso血库专用离心机。
5．操作步骤。
（1）抗凝全血2ml，放入离心机中，（900～1000）×g离心5min，吸取上层血浆。
（2）加入生理盐水5ml，混匀，洗涤，放入离心机内，（900～1000）×g离心3min，取出试管，弃去上清液，重复操作3次，末次离心时间增加至5min，制备成压积红细胞。
（3）不同浓度红细胞悬液的配制。
①5%红细胞悬液的配制。取试管1支，加入压积红细胞1滴，加入生理盐水19滴，制备成5%红细胞悬液。
②2%红细胞悬液的配制。取5%红细胞悬液2滴，加入生理盐水3滴，制备成2%红细胞悬液。
③1%红细胞悬液的配制。取5%红细胞悬液2滴，加入生理盐水8滴，制备成1%红细胞悬液。
（三）血型抗体效价试验操作规程
1．原理：将被测抗血清用生理盐水倍比稀释后，加入一定量的抗原红细胞，观察凝集强度。以抗体稀释后仍能与抗原红细胞出现肉眼明显可见凝集的最高血清稀释倍数的倒数来表示抗体的效价。
2．标本：A、B标准抗血清。
3．试剂：
（1）生理盐水。
（2）标准2%A、B型红细胞生理盐水悬液。
4．仪器：Baso血库专用离心机。
5．操作步骤。
（1）取10支小试管，用加样器每管加生理盐水100μl，在第1管中加入100μl被检标准A（或B）血清，混匀后吸取100μl加入第2管，依次类推，至第10管，最后弃去100μl。1～10管的稀释度分别是1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024。
（2）于每管中加入2%A（或B）型标准红细胞生理盐水悬液100μl，混匀。
（3）室温孵育15min。
（4）以3400r/min1000g离心15～30s，以第一个出现“±”凝集强度试管的血清稀释倍数的倒数为该抗血清的效价。
（5）结果判断（见表12-5）。
6．注意事项。
（1）稀释操作时要准确，避免稀释不匀出现“跳管”现象。
（2）稀释液的容量越小，可能产生的误差越大。如果可能，可以增大稀释容量。
7．结果报告：以出现±凝集强度试管的血清稀释倍数的倒数为该抗血清的效价。
（四）ABO血型鉴定标准操作规程
方法一：玻片法、试管法。
1．原理：根据红细胞上有无A抗原或（和）B抗原，将血型分为A型、B型、AB型和O型四种，可利用红细胞凝集试验通过正（血清试验）反（细胞试验）定型准备鉴定ABO血型。
ABO血型的鉴定必须用已知抗A和抗B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原和B抗原，用已知混合的A型红细胞和B型红细胞检测血清中有无相应的抗A和抗B，这两种试验可以作为相互验证的质量控制方法。
2．标本：静脉抗凝或不抗凝血1.5～2.0ml。
3．试剂：
（1）单克隆抗A、抗B标准血清。
（2）5％A、B及O型试剂标准红细胞盐水悬液。
（3）10mm×60mm试管或玻片。
4．仪器：Baso血库专用离心机。
5．操作步骤。
（1）玻片法。
①查抗原。取清洁玻片1张，用记号笔分别标明抗A、抗B，用滴管加入抗A和抗B分型试剂各1滴于玻片标记相对应处，再以滴管分别加入受检者10%红细胞盐水悬液1滴，混匀。
②查抗体。取清洁玻片1张，用记号笔分别标明A型、B型和O型细胞。用滴管分别加入受检者血清2滴于玻片标记相对应处，再分别以滴管加入A、B、O型5%试剂红细胞悬液1滴，混匀。
③将玻片不断轻轻转动，使血清与细胞充分混匀，连续约2min，以肉眼观察有无凝集反应。如肉眼观察不见凝集，应再在低倍镜下观察有无凝集或溶血。
④结果报告。a.凝集为阳性结果。b.细胞均匀悬液2min后为阴性结果。c.对结果有怀疑，应用试管法重新实验。
⑤备注。a.玻片法不适用于病人和献血员血清中的ABO抗体的测定。b.不要混淆干燥的边缘与凝集。
（2）试管法。
①查抗原：取洁净小试管2支，分别标明抗A、抗B，用滴管加入抗A、抗B分型试剂各1滴于试管底部，再以滴管分别加入受检者5%红细胞盐水悬液1滴，混匀。
②查抗体：取洁净小试管4支，分别标明Ac、Bc、Oc和自身c。用滴管分别加受检者血清2滴于试管底部，再分别以滴管加入A、B、O型5%试剂红细胞悬液以及受检者自身红细胞悬液各1滴。
③将上述混匀后，放置10min，以3400r/min1000g离心15～30s。
④轻轻重悬细胞扣，先以肉眼观察有无凝集（或溶血）现象，如肉眼观察不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜下观察有无凝集。查抗原凝集强度为4+才可排除亚型，查抗体室温反应凝集强度≥2+排除抗体减弱。
⑤凝集强度判断标准（见表12-6）。
方法二：微柱凝胶法。
1．原理：
（1）人红细胞抗原与相应抗体发生特异性免疫反应（其本质为血凝反应）。
（2）检测系统是在微柱中（载体）将反应介质凝胶（sephdexG-100或50葡聚糖胶）或小玻璃珠装入微柱中。
（3）凝胶或小玻璃珠的间隙具有分子筛作用。凝集的红细胞（结合的）被留在微柱上面成带状或凝集颗粒散布凝胶中间。未凝集的红细胞（即未结合、游离的）通过离心后沉入微柱的底部。
（4）微柱凝胶中所含的特异性单克隆抗-A、抗-B试剂检测红细胞上相应的血型抗原，或在含凝胶的微柱上用标准A、B型红细胞检测血清中相应的血型抗体，从而鉴定红细胞的血型。
2．标本：静脉抗凝或不抗凝血1.5～2.0ml。
3．试剂：
（1）微柱凝胶检测卡。
（2）0.8％A、B型试剂标准红细胞盐水悬液。
4．仪器：Dianafuge血库专用卡式离心机。
5．操作步骤。
（1）查抗原。在微柱凝胶检测卡的A和B孔中加入受检者0.8%的红细胞生理盐水悬液一滴（或50μl）；即刻使用微柱凝胶离心机，以1000r/min离心10min，取出观察结果。
（2）查抗体。在微柱凝胶检测卡的RGA1、RGB和质控Ctrl孔中加入相应的标准0.8%A、B型试剂红细胞盐水悬液和被检血清各一滴（或50μl），即刻使用微柱凝胶离心机，以1000r/min离心10min，取出观察结果。
（3）结果判断。阳性反应，红细胞抗原与抗体结合是红细胞发生凝集，在离心后浮在凝胶表面或胶中；阴性反应，被检红细胞无相应抗原结合，在离心后红细胞沉于微柱的底部。检测结果：
①质控管应为阴性反应。
②A孔阳性B孔阴性、RGA1孔阴性RGB孔阳性为A型。
③A孔阴性B孔阳性、RGA1孔阳性RGB孔阴性为B型。
④A孔、B孔均阴性、RGA1孔、RGB孔均阳性为O型。
⑤A孔、B孔均阳性、RGA1孔、RGB孔均阴性为AB型。
6．注意事项。
（1）严格按操作规程操作，认真核对标本并做好标记。
（2）所用试管、滴管和玻片必须清洁干净，防止溶血。
（3）应先加血清，然后再加红细胞悬液，以便容易核实是否漏加血清。
（4）抗血清每次使用完后，应放回冰箱保存，以免细菌污染。
（5）为了防止冷凝集现象的干扰，一般应在室温下进行试验。
（6）严格控制离心速度和时间，防止假阳性或假阴性结果。
（7）观察时应注意红细胞呈特异性凝集、继发性凝固以及缗钱状排列的区别。
（8）未用的微柱凝胶免疫检测卡应室温保存，用完后4℃冰箱保存1w。
（9）观察结果时，若出现溶血现象，表明存在抗原抗体反应并有补体激活，应视为凝集。
（10）判断结果后应仔细核对，记录，避免笔误。
（11）分型试剂+受检者红细胞、受检者血清+试剂红细胞结果不符时，要看受检者基本情况，如果是婴幼儿、肿瘤患者，理论上应该检测到抗体没有查到，可以忽略不计，以查到抗原的定型。
（12）分型血清+受检者红细胞、受检者血清+试剂红细胞结果不符时，受检者基本情况，又不是婴幼儿、肿瘤患者，理论上应该检测到的抗体没有查到，多见老年人，可以用以下方法加以检测抗体：
①用试管法重做，在做完1、2步后，把试管放4℃环境15min，取出后离心，观察结果。
②用试管法重做，在做完1、2步后，把试管放37℃环境15min，取出后离心，观察结果。
③用试管法重做，用聚凝胺方法查抗体：a.取洁净小试管3支，分别标明A型、B型和O型细胞。用滴管分别加入受检者血清2滴于试管底部，再分别以滴管加入A、B、O型5%试剂红细胞悬液1滴，混匀。b.于3个试管中分别加入低离子强度液0.7ml、聚凝胺液2滴，混匀。c.以3400r/min1000g离心15～30s。d.倒掉上清液，管底残液体留约0.1ml。e.轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重做。f.加入再悬液2滴，轻轻转动试管混合并同时观察结果。如在30s至1min内凝集散开，代表是由聚凝胺引起的非特异性凝集；如凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应。如反应可疑，可进一步倒在玻片上用显微镜观察。
（13）反定型O细胞是随机3人份红细胞混合所配，没有代表性，只作为阴性对照，针对冷抗体排除假阳性，也可排除患者血清中的蛋白凝集引起的假凝集。而不能作为筛选细胞检测不规则抗体。
7．临床意义。
（1）血型鉴定是实施输血治疗的首要步骤。进行交叉配血前必须准确检测受血者和供血者的血型。
（2）进行组织器官移植时，供、受器官者的ABO系统血型必须相同。
（3）母、子ABO系统血型不合可引起ABO系统新生儿溶血病。
（4）检测抗体的目的在于复检血型抗原结果的准确性，纠正漏检、误报。
（6）检测抗体可以纠正某些肿瘤患者因红细胞抗原性减弱造成的抗原检测错误，同时还可以克服和排除获得性类B抗原和全凝集现象对红细胞定型的干扰。
（7）检测抗体还可以发现血清中存在的一些不规则抗体，如抗M、抗N、抗P、抗Lewis等。
（五）A亚型鉴定标准操作规程
1．原理。根据ABO血型血清学特点，A型和AB型可分为A1、A2、A1B和A2B四种亚型。抗A血清中含有抗A和抗A1两种抗体，抗A抗体可以凝集所有A型和AB型红细胞，而抗A1抗体只能与一部分A型和AB型红细胞反应。据此凡与抗A1血清反应者被指定为A1或A1B亚型；不与抗A1血清反应者指定为A2或A2B亚型。
2．标本：静脉抗凝或不抗凝血1.5～2ml。洗涤后配成3%～5%红细胞生理盐水悬液备用。
3．试剂：
（1）单克隆或多克隆抗A1试剂。
（2）生理盐水。
（3）A1和A2亚型5％红细胞盐水悬液。
4．仪器：Baso血库专用离心机，显微镜。
5．操作步骤。
（1）取3支小试管，一支测定受检者红细胞。另2支作为对照并标明A1和A2。
（2）将单克隆或多克隆抗A1试剂分别在受检者小试管中和对照小试管的A1和A2中各加1滴。
（3）将受检者3％～5％红细胞盐水悬液加1滴于受检者小试管中。
（4）将对照用A1和A2红细胞盐水悬液相应各加1滴于小试管的A1和A2中。
（5）摇匀，立即以3400r/min1000g离心15～30s。
（6）轻轻摇动，在低倍镜下观察结果。
（7）结果判断：如A1对照红细胞凝集，而A2对照红细胞不凝集，说明该试验结果可靠。
此时如果受检者红细胞凝集者为A1型，不凝集者为A2型。
6．注意事项。
（1）对其他亚型的鉴定还须做吸收与放散试验来确定，如出现鉴定困难，可采用分子生物学的方法鉴定。
（2）用A2红细胞吸收过的B型人血清和双花扁豆种子提取液测定结果，可采用A1和A2细胞是抗原量的变化，而从A2或A2B的人所产生的抗A1观察，A1和A2红细胞A抗原是质的不同。因此，检查时必须掌握好反应时间。
（3）如A1和A2对照红细胞都凝集或都不凝集，表示抗A1血清不纯或有其他质量问题。
（4）新生儿红细胞ABO血型抗原较弱，不宜作A1和A2亚型鉴定。
7．临床意义。
（1）若A1和A2基因共同遗传时，人体的表型为A1亚型，此时A2基因被A1基因所隐蔽。当A2基因与B和O基因配对时，则人体的表型将为A2或A2B亚型。
（2）在常规输血试验中，除非A2或A2B亚型人的血清含有A1抗体，患者与供者间的A1或A2亚型不需加以区别。
（3）只有在37℃有反应的抗A1亚型，才考虑具有临床意义，因其能造成红细胞与血清试验间的ABO定型不符，且亦可引起交叉配血试验不相合。
（六）RhD血型鉴定标准操作规程
1．原理。Rh血型系统主要有5种抗血清，即抗C、抗c、抗D、抗E、抗e。用5种抗Rh分型血清来检查红细胞抗原，可能有18种表现型。在临床输血中，一般只做D抗原的鉴定，凡被检红细胞和抗D血清凝集者为RhD阳性，不凝集者为RhD阴性。其他Rh抗原鉴定和D抗原一样，只是加相应的抗血清即可。其鉴定方法，由抗血清的性质而定，如盐水抗体用盐水法，IgG抗体用酶、抗人球蛋白、聚凝胺等方法。
2．试剂。
（1）Rh抗血清。包括多克隆高蛋白，化学修饰低蛋白或混合型IgM/IgG，单克隆/多克隆低蛋白的试剂。
（2）5%D阳性和阴性红细胞生理盐水悬液。
（3）AB型人的血清。
（4）生理盐水。
3．仪器：Baso血库专用离心机，显微镜。
4．操作步骤。
（1）玻片法。
①在一块标记的玻片方格中加1滴抗血清试剂。
②在第二块标记的玻片上加1滴合适的对照试剂。
③在每块玻片上加2滴（用自身或血型相合的血清或血浆）混合好的受检者40%～50%细胞悬液。
④对每块玻片用一支干净的加样杆细胞悬液与试剂充分混合，并把混合物均匀涂开，使其覆盖玻片表面大部分。
⑤慢慢连续倾斜玻片并观察凝集。大多数厂家规定实验必须在2min内判读结果。
⑥结果判读：a.抗D血清玻片上出现凝集而对照玻片上是均匀的红细胞悬液时是阳性结果。b.抗D和对照玻片上都是均匀的细胞悬液时，提示是阴性结果，如果要做变异性D和不规则D试验必须用试管采用抗人球蛋白法，玻片上不能做可靠的变形型D和不完全D试验。c.如对照玻片上出现凝集，在未经进一步试验之前，不能解释为阳性结果。
