实验目的
（1）掌握黄曲霉毒素的检验方法。
（2）了解免疫亲和层析法检验黄曲霉毒素的原理。
实验原理
黄曲霉毒素（aflatoxin，简称AFT）是一类结构相似的化学物质，均具有一个二呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）结构。目前分离到的AFT及其衍生物已有20多种，其中10余种的化学结构已经明确，并给以下命名：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、B2a、M1、M2、B3、BM1、GM1、GM2、RO、P1、Q1等，前4种通常是共存的。
AFT是已被证实的致癌物，其中黄曲霉毒素B1的致癌性最强。其作用机理是影响细胞膜，抑制RNA合成并干扰某些酶的感应方式。AFT中毒症状无特异性表现，按症状的严重程度不同，临床可表现为发育迟缓、腹泻、肝肿大、肝出血、肝硬化、肝坏死、脂肪渗透、胆道增生等。AFT对热很稳定，一般烹调加工温度不能将其破坏。黄曲霉毒素M1是一种能导致肝癌的霉菌毒素，它会出现在饲喂含有黄曲霉毒素B1饲料的奶牛所产的乳中。
AFT的检测方法很多，其中薄层层析法和液相色谱法是目前国内多数检测机构使用的方法。但其缺点是检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多，已不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的发展，人们已创建了几种快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的AFT检测方法。尤其免疫学方法应用较多，例如酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫亲和―光分光光度法、免疫亲和―效液相色谱法等。ELISA仅能检测单一毒素（如黄曲霉毒素B1）的含量，且易出现假阳性结果。免疫亲和―光分光光度法操作简单快速，定量准确，检测一个样品只需10～15min，可以检测黄曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）总量，检测限可达到1μg/kg。现今先进国家广泛使用的金标试纸法是一个检测方面的新亮点。
本实验采用免疫亲和―光分光光度法，检测花生中的黄曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）总量。其检测原理是：试样经过甲―提取，被过滤和稀释的提取液经含有黄曲霉毒素特异性抗体的免疫亲和层析净化。此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用纯水将免疫亲和层析柱上的杂质除去，以甲醇洗脱免疫亲和层析柱上的黄曲霉毒素，在洗脱液中加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。衍生化后的洗脱液通过荧光分光光度计测定黄曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）总量。
实验材料
（一）检样
发霉的饲料或饲喂发霉饲料奶牛所产的乳。
（二）试剂
甲醇（色谱级）、甲―（7+3）、甲―（8+2）、氯化钠（分析纯）、溴溶液储备液（0.01%，避光保存）、溴溶液工作液（0.002%，取0.01%溴溶液储备液10mL，加水40mL，棕色瓶保存，临用前现配）、二水硫酸奎宁。
硫酸溶液（0.05mol/L）：取2.8mL浓硫酸，缓慢加入适量水中，冷却后定容至1000mL。荧光分光光度计校准溶液：称取3.40g二水硫酸奎宁，用0.05mol/L 1/2 H2SO4溶液稀释至100mL。此溶液荧光分光光度计读数相当于20μg/L黄曲霉毒素标准溶液。
（三）仪器及其他用品
玻璃注射器（10mL、20mL）、玻璃试管（12mm×75mm，无荧光性）、玻璃纤维滤纸（直径11cm，孔径1.5μm）、具塞三角瓶（250mL）、荧光分光光度计、高速均质器、黄曲霉毒素免疫亲和柱（VICAM公司）、空气压力泵。
实验流程
试样→提取→净化→荧光分光光度计测定
实验步骤
（一）样品提取
准确称量经过磨细（粒度＜2mm）的试样25.0g于250mL具塞三角瓶中，加入5.0g氯化钠及甲―（7+3）至125.0mL（V1），以均质器高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，准确移取15.0mL（V2）滤液并加入30.0mL（V3）水稀释，玻璃纤维滤纸过滤1～2次，至滤液澄清，备用。
（二）净化
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下。准确移取15.0mL（V4）滤液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2～3mL，空气通过柱体。以10mL纯水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2～3mL空气通过柱体。准确加入10mL色谱级甲醇洗脱，流速为10mL/min，收集全部洗脱液（V）于玻璃试管中，供检测用。
（三）荧光分光光度计测定
1.荧光分光光度计校准
在激发波长360nm、发射波长450nm条件下，以0.05mol/L硫酸溶液为空白，调节荧光分光光度计的读数值为0.0μg/L；用荧光分光光度计校准溶液调节荧光分光光度计读数值为20.0μg/L。
2.样品测定
取上述净化后的甲醇洗脱液加入1.0mL 0.002%溴溶液，混匀，静止1min，按1条件进行操作，于荧光分光光度计中读取样液中AFT（B1+B2+G1+G2）的浓度（ρ1）（μg/L）。
3.空白试验
用水代替试样，按（一）～（三）步骤做空白试验，于荧光分光光度计中读取水中AFT（B1+B2+G1+G2）的浓度（ρ0）（μg/L）。
4.结果计算
实验结果与报告
列表记录实验过程中各步结果，并据此做出结论。
思考题
在实验中黄曲霉毒素免疫亲和柱的作用是什么？
