实验目的
学会用红四氮唑还原试验法对鲜乳中抗生素残留量的检验方法。
实验原理
检验鲜乳中是否残留抗生素，目前常规采用指示剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑（简称红四氮唑，用TTC表示）来测定。TTC在氧化态时为无色，还原态时为粉色或红色。试验时先在杀菌的鲜乳中加入敏感菌株――嗜热链球菌培养液，水浴培养一定时间。该菌在生长繁殖过程中产生还原酶及其他还原型物质，能使TTC由氧化型（无色）还原为还原型物质（红色）。若鲜乳中有抗生素残留，敏感菌株的增殖即被抑制，指示剂TTC不能还原为红色化合物，因而检样不显色；反之，若无抗生素残留，则加入的敏感菌株即行增殖，TTC还原而显红色。
牧场常用大量抗生素预防和治疗奶牛乳房炎等疾病，使鲜乳在一定时间内残留半衰期较长的抗生素。此外，为了延长鲜乳保存期，人为掺入抗生素，均可引起部分人群的过敏反应，亦可抑制生产菌种的生长而严重影响发酵乳制品的正常生产。因此，检验鲜乳中抗生素的残留量具有实际意义。
实验材料
（一）样品
鲜牛乳（原料乳）。
（二）敏感菌株
嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）37℃，8～12h脱脂乳纯培养物。
（三）培养基
脱脂乳培养基（培养基18），用大试管装量10mL，0.07MPa灭菌15～20min。
（四）试剂
4%浓度的TTC水溶液：称取1gTTC溶于5mL灭菌蒸馏水中，装褐色瓶内于7℃冰箱保存，临用时用灭菌蒸馏水稀释5倍。如遇溶液变为土色或淡褐色，则不能再用。
（五）仪器及其他用品
水浴锅、培养箱、温度计、记号笔、试管架、灭菌吸管（1mL、10mL）、灭菌试管（15mm×150mm）。
实验流程
TTC法抗生素残留检验程序。
实验步骤
（一）菌液制备
将菌种移种于10mL脱脂乳中，经（36±1）℃培养8～12h至乳凝固后，以灭菌脱脂乳1：1稀释待用。
（二）鲜乳杀菌与加菌液培养
取检样9mL，置于15mm×150mm试管内，80℃水浴加热5min冷却至37℃以下，加菌液1mL，（36±1）℃水浴培养2h。
（三）加TTC
向上述培养液中加入0.3mLTTC，（36±1）℃水浴培养30min，观察如为阳性，再于水浴中培养30min作第二次观察，每份检样做两份。此外再做阴性和阳性对照各一份。阳性对照管用无抗生素的鲜乳8mL加入抗生素、菌液和TTC。阴性对照管用无抗生素鲜乳9mL加菌液和TTC。
（四）判断方法
准确培养30min观察结果，如为阳性，再继续培养30min作第二次观察。观察时要迅速，避免光照过久发生干扰。鲜乳中有抗生素存在，指示剂TTC不显色，检样呈乳的原色时为阳性；如果无抗生素，TTC被还原而呈红色为阴性。显色状态判断标准与检测各种抗生素的灵敏度。
实验结果与报告
判断鲜牛乳中有无抗生素。
思考题
（1）简述用TTC法检测鲜牛乳中抗生素的原理与方法。
（2）除TTC法外，还有哪些较先进的方法检测食品中抗生素的残留量？
